本研究由Mengmeng Dong, Yumeng Liu, Yuting Xiao, Qingqing Wu, Mingjing Guan, Zunqiang Xiao, Junwei Liu, Lidong Cao, and Yi Lu* 合作完成。主要研究机构为浙江大学医学院附属人民医院/杭州医学院附属人民医院肝胆胰外科及微创外科、癌症中心，以及部分作者所在的检验中心与输血科。该研究以论文形式“tumor-targeted plga nanospheres enhance therapeutic effect of lenvatinib in hepatocellular carcinoma via photothermal and photodynamic therapy”发表于期刊 ACS Applied Materials & Interfaces，于2025年7月21日在线发表。
本研究属于生物医学工程与肿瘤纳米治疗学交叉领域。其学术背景植根于当前肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）治疗的严峻挑战。HCC是全球范围内最常见且最具侵袭性的肝癌类型，治疗选择有限，复发率高。乐伐替尼（Lenvatinib, LVN）作为晚期HCC的一线全身治疗药物，尽管疗效与索拉非尼相当且在无进展生存期上更具优势，但其长期使用伴随蛋白尿、手足综合征、皮疹、肌痛以及耐药性等显著副作用，限制了其临床应用。传统的纳米递送系统虽能改善药物稳定性与靶向性，但普遍存在主动靶向能力不足、释放控制不佳等缺陷，且鲜有将光疗（光动力疗法/光热疗法）与乐伐替尼联用的策略。光动力疗法（Photodynamic Therapy, PDT）和光热疗法（Photothermal Therapy, PTT）因其低毒性、微创和高时空可控性，已成为癌症治疗的新兴手段。基于此，本研究旨在设计并构建一种集诊断与治疗于一体的多功能纳米球，用于共递送乐伐替尼和光敏剂IR780，以期通过CRGD肽的主动靶向作用，实现药物在肿瘤部位的富集，并利用808 nm激光激发的PDT/PTT效应与化疗药物产生协同作用，从而增强对HCC的治疗效果，同时降低系统毒性，并实现荧光成像（FLI）、光声成像（PAI）和光热成像（PTI）等多模式可视化诊断。
研究的详细工作流程系统而严谨，涵盖了纳米颗粒的制备表征、体外细胞实验、机制探索以及体内动物实验等多个阶段。首先，在纳米系统的设计与合成阶段，研究团队采用溶剂乳化蒸发法，以马来酰亚胺修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇（PLGA-PEG-Mal）为骨架，与环肽cRGD、光敏剂IR780以及甲磺酸乐伐替尼共同溶解于三氯甲烷中，然后注入含有表面活性剂聚乙烯醇（PVA）的水溶液中，经机械搅拌、离心纯化后，成功制备了名为PPR@LVN/IR780的纳米球。通过透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）确认了纳米颗粒呈均匀球形，直径约200纳米。动态光散射（DLS）和Zeta电位分析进一步证实了其水合粒径约为210 nm，且随着LVN和IR780的负载，电位发生变化，证明了药物的成功包封。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和核磁共振（NMR）验证了cRGD的成功修饰。对载药性能的评估显示，LVN和IR780的包封率（EE）分别为96.5%和36.7%，载药量（DL）分别为8.62%和2.83%。体外释放实验表明，纳米球在酸性环境（pH 5.0和6.5）下释放更快，具有良好的肿瘤微环境响应性。光热性能测试显示，PPR@LVN/IR780在808 nm激光照射下能有效将光能转化为热能，其光热转换效率（η）计算为22.8%，并展现出良好的光热稳定性。
其次，在体外生物安全性与细胞摄取评估阶段，研究首先评估了纳米载体（PPR）的生物相容性。溶血实验表明，即使在高达200 μg/mL的浓度下，PPR引起的溶血率也极低（约5%），证明其对红细胞无害。细胞毒性实验（CCK-8法）显示，PPR载体本身对Huh7细胞无明显毒性。接着，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和流式细胞术分析了纳米颗粒的细胞摄取行为。结果显示，PPR@LVN/IR780能被Huh7细胞有效内吞，荧光信号随时间增强，并在12小时达到较强水平。更重要的是，通过使用溶酶体追踪探针（LysoTracker Red）共定位实验，研究者观察到纳米颗粒在孵育6小时后与溶酶体共定位（呈现黄色荧光），而在12小时后，绿色荧光（纳米颗粒）与红色荧光（溶酶体）发生分离，这表明纳米颗粒成功实现了“溶酶体逃逸”，为其在细胞质中释放药物并发挥作用提供了条件。此外，对比实验证实，经cRGD修饰的纳米颗粒具有更强的细胞靶向摄取能力。
第三，在体外抗肿瘤疗效与初步机制探索阶段，研究系统比较了不同处理组对Huh7细胞的影响。CCK-8实验表明，PPR@LVN/IR780在808 nm激光照射（+L组）下显示出最强的细胞生长抑制能力，其半数抑制浓度（IC50）为6.5 μg/mL，远低于游离LVN（30.58 μg/mL）和未加载光敏剂的PPR@LVN（13.30 μg/mL），证明了光疗的协同增效作用。EdU增殖实验显示，PPR@LVN/IR780 (+L)组细胞增殖信号几乎完全消失。Calcein-AM/PI活死细胞染色进一步直观显示，该组死细胞（红色）比例最高。为了探究细胞死亡的具体机制，研究者使用了多种细胞死亡抑制剂（如凋亡抑制剂Z-VAD、铁死亡抑制剂Fer-1和Lip-1、坏死性凋亡抑制剂Nec-1等）与PPR@LVN/IR780 (+L)共处理细胞。结果显示，Z-VAD、Fer-1、Lip-1和Nec-1均能显著逆转纳米颗粒联合激光处理导致的细胞活力下降，提示该治疗同时诱发了细胞凋亡和铁死亡。
第四，在深入探究细胞分子机制阶段，研究通过一系列实验验证了上述猜想。流式细胞术检测细胞凋亡（Annexin V-FITC/PI染色）证实，PPR@LVN/IR780 (+L)组诱导了最高比例的凋亡细胞（88.36%）。活性氧（ROS）检测（DCFH-DA探针）显示，该组细胞内ROS水平急剧升高，这是PDT效应的典型标志。同时，用于检测脂质过氧化（LPO）的BODIPY C11探针显示，该组细胞的氧化态（绿色）荧光增强，还原态（红色）荧光减弱，表明脂质过氧化积累，是铁死亡的关键特征。线粒体膜电位（JC-1探针）检测发现该组线粒体膜电位显著下降。透射电镜（TEM）和线粒体特异性染色（Mito-Tracker）进一步观察到线粒体出现肿胀、嵴断裂等与铁死亡相关的超微结构改变。Western Blot蛋白印迹分析从分子水平提供了证据：PPR@LVN/IR780 (+L)处理下调了抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表达，同时激活了凋亡执行蛋白Caspase-3和PARP的切割形式；另一方面，铁死亡的关键负调控蛋白——胱氨酸/谷氨酸转运体轻链亚基SLC7A11（又称xCT）、其伴侣蛋白SLC3A2、铁死亡抑制蛋白1（FSP1）以及谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的表达均被显著抑制。这些结果共同证实，808 nm激光激活的PDT/PTT效应，协同释放的LVN，共同触发了Huh7细胞的凋亡和铁死亡程序。
第五，在高通量测序探索全局性机制阶段，研究运用转录组测序（RNA-seq）和蛋白质组质谱分析（Proteomics MS）技术，从全局视角揭示了纳米疗法的作用网络。转录组分析发现，与对照组相比，PPR@LVN/IR780 (+L)处理组共有5257个差异表达基因（DEGs）。KEGG通路富集分析显示，这些基因显著富集于PI3K-Akt信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、NOD样受体信号通路、TNF信号通路、铁死亡、VEGF信号通路和凋亡通路等。基因集富集分析（GSEA）也确认了铁死亡通路被激活。特别重要的是，研究者将本研究中差异表达的基因与已报道的乐伐替尼耐药Huh7细胞的差异表达蛋白进行交叉比对，发现了34个共有分子，这些分子主要富集在PI3K-Akt通路（如RRM2、TNFRSF10B等）。GSEA分析证实，PPR@LVN/IR780 (+L)处理能够逆转与乐伐替尼耐药相关的PI3K-Akt信号通路的异常激活。此外，蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析发现，铁死亡关键蛋白SLC7A11与TP53（p53蛋白）和ATF4紧密相关。TP53是调控PI3K-Akt通路的重要分子，而ATF4是整合应激反应和凋亡的关键因子。这从系统生物学的角度揭示了纳米疗法的作用逻辑：激光激发的PDT/PTT效应触发了强烈的氧化应激和热损伤，一方面直接导致细胞凋亡，另一方面通过抑制SLC7A11等引发铁死亡；同时，通过干预SLC7A11-TP53-PI3K-Akt轴，可能逆转了肿瘤细胞对LVN的耐药性，从而放大了化疗效果。
第六，在体内抗肿瘤效果与多模式成像验证阶段，研究在Balb/c裸鼠上构建了Huh7细胞皮下移植瘤模型。将荷瘤小鼠随机分为5组：PBS对照组、游离LVN组、PPR@LVN组、PPR@LVN/IR780组以及PPR@LVN/IR780联合808 nm激光照射组（+L组）。结果显示，PPR@LVN/IR780 (+L)组的肿瘤生长被最有效地抑制，肿瘤体积最小。肿瘤组织切片分析显示，该组的TUNEL阳性（凋亡细胞）信号最强，而Ki-67（增殖标记物）和GPX4（铁死亡抑制蛋白）的表达最弱，与体外实验结果一致。在诊断成像方面，该纳米系统展现了卓越的多功能：荧光成像（FLI） 显示纳米颗粒能在注射后于肿瘤部位持续富集长达24小时；光声成像（PAI） 在注射后6小时于肿瘤区域检测到强烈的信号，实现了精准定位；光热成像（PTI） 则在激光照射下直观显示了肿瘤部位的温度显著升高（达50.5°C），验证了其PTT能力。重要的是，对主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色以及血清生化指标（ALT、AST、CREA、BUN）检测均未发现明显损伤或异常，证明了该纳米系统具有良好的体内生物安全性和生物相容性。
本研究的结论是：成功设计并构建了一种基于PLGA-PEG-cRGD的多模式诊疗一体化纳米微球PPR@LVN/IR780。该系统不仅实现了对一线化疗药物乐伐替尼和光敏剂IR780的高效共包载与肿瘤主动靶向递送，更重要的是，通过808 nm激光激发的PDT和PTT效应，与乐伐替尼产生了显著的协同抗肿瘤作用。其作用机制涉及诱导肿瘤细胞发生凋亡和铁死亡，并通过调控SLC7A11-TP53-PI3K-Akt轴可能逆转乐伐替尼耐药。此外，该系统集FLI、PAI和PTI三种成像模式于一体，为肝癌的可视化诊断与治疗监测提供了有力工具。该研究为拓展HCC的协同诊疗策略提供了一种兼具高效、低毒和可视化功能的新型纳米药物平台，具有重要的科学价值与临床转化潜力。
本研究的亮点在于：第一，策略的创新性：创造性地将一线化疗药乐伐替尼与光疗（PDT/PTT）通过智能纳米载体结合，并赋予其主动靶向（cRGD）和微环境响应释放能力，实现了化疗与物理疗法的多模式协同治疗。第二，机制的深度解析：不仅证实了凋亡和铁死亡两条死亡通路的同时激活，还利用高通量转录组和蛋白质组学技术，从系统层面揭示了其逆转耐药可能的信号网络（如PI3K-Akt通路），为理解其协同增效提供了超越表型的分子见解。第三，诊疗一体化设计：该纳米平台并非简单的药物递送系统，而是整合了三种互补的成像模式（FLI、PAI、PTI），真正实现了“看到哪里，打到哪里”的诊疗一体化理念，为精准医疗提供了工具。第四，完备的验证体系：研究从材料表征、体外细胞安全性与功效、体外深层机制、到体内药效、成像验证及生物安全性评价，形成了完整、严谨的证据链，结果可靠。
其他有价值的内容包括：研究团队对纳米颗粒的稳定性、光热转换效率、载药比例协同指数（CI）等关键参数进行了细致的优化与量化；在体外机制探索中，综合运用了多种细胞功能检测方法（如线粒体膜电位、脂质过氧化、线粒体形态电镜观察等）和分子生物学技术，使得结论坚实；体内实验不仅关注抑瘤效果，还通过多时间点成像动态展示了纳米颗粒的生物分布与肿瘤靶向富集过程，直观有力。这些细节共同支撑了该项研究的高质量与完整性。