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一、研究作者、机构与发表信息
本研究由Neha Khera、Asvika Soodhalaagunta Rajkumar、Khlood Abdulkader M Alkurdi、Zhiao Liu、Hong Ma、Ahmad Waseem及Muy-Teck Teh等人共同完成。通讯作者为Muy-Teck Teh，其隶属机构为伦敦玛丽女王大学牙医学院（Queen Mary University of London, Institute of Dentistry, Barts and The London School of Medicine and Dentistry）口腔免疫生物学与再生医学中心，以及贵州医科大学附属口腔医院的中英联合分子头颈癌研究实验室。该论文发表于*Molecular Cancer*期刊，于2023年8月18日被接收，文章编号为22:146，可通过DOI: 10.1186/s12943-023-01846-3访问。
二、研究背景
头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）占所有头颈部恶性肿瘤的90%。虽然早期HNSCC患者通过手术和/或放疗可获得70–90%的五年总生存率，但约三分之二的患者初诊时已处于晚期，治疗选择有限且易发生治疗失败，导致HNSCC患者的长期生存率数十年来仍维持在约50%，未见显著改善。对于需要多模式治疗（multimodal therapy）的HNSCC患者，顺铂（cisplatin）、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5FU）、紫杉醇（paclitaxel, PTX）和多西他赛（docetaxel, DTX）是最常用的化疗药物。然而，肿瘤细胞对化疗和/或放疗产生耐药性是导致治疗失败和不良预后的主要原因。与其他癌种（如肺癌、乳腺癌）不同，HNSCC患者的治疗几乎不基于肿瘤的分子遗传特征进行个体化选择，这主要源于对HNSCC分子异质性认识的不足。已有研究揭示了HNSCC中多种内在化疗耐药机制，涉及凋亡/细胞死亡、DNA损伤修复、上皮间质转化、细胞周期、肿瘤干细胞、表观遗传调控、microRNA加工、自噬及基质/免疫细胞互作等通路。然而，在治疗决策前利用分子标志物对HNSCC患者进行风险分层仍处于起步阶段。本研究旨在通过整合生物信息学转录组数据挖掘、化疗耐药细胞系模型中的差异基因表达分析、临床HNSCC组织样本验证、药理学剂量-反应药物库筛选及细胞培养模型，鉴定关键的多药耐药生物标志基因，并探索重新利用现有药物以克服化疗耐药的策略。
三、研究流程与实验设计
该研究包含多个连贯的实验步骤：
转录组数据挖掘与候选基因筛选：研究者对8个独立的HNSCC微阵列研究进行meta分析，利用Oncomine癌症微阵列数据库比较HNSCC与正常口腔黏膜的差异表达基因。根据报道的p值（>0.001）初步筛选出前40个差异表达基因。随后，利用反转录定量PCR（RT-qPCR）在8株原代正常人口腔角质形成细胞（OK355、HOKG、OK113、NOK、NOK1、NOK3、NOK16、NOK376）和10株HNSCC细胞系（SCC4、SCC9、SCC15、SCC25、SQCC/Y1、UK1、VB6、CALH2、CADEC12和5PT）中量化这40个基因的表达，以验证差异表达。最终鉴定出28个差异表达基因，这些基因涉及基质重塑、免疫调节、细胞增殖与分化、干细胞更新、表观遗传编程及基因组不稳定性的调控。
多药耐药共同基因的鉴定：为鉴定在不同分子背景下介导化疗耐药的共同基因，研究者选择了3株具有不同分子背景的细胞系：口腔癌前病变源性的SVpgC2a、致癌物（尼古丁）转化恶性的SVFN8以及患者HNSCC肿瘤来源的CALH2。针对每株细胞系，分别建立对顺铂、5FU、PTX和DTX耐药的4种耐药细胞株（R1–R4），共产生12种细胞/药物耐药组合。对每种组合，分别以相应药物处理野生型（wild type, WT）与耐药细胞株，并通过RT-qPCR测量28个基因的药物剂量依赖性表达变化。通过t检验和回归分析，确定耐药株与野生型之间的差异表达基因。将28个基因按其在12种细胞/药物组合中作为显著差异基因出现的频率降序排列，最终选出排名前四的上调基因：TOP2A、DNMT1、INHBA和NEK2，用于后续功能研究。
临床组织样本中的差异表达验证：为确认这4个基因在HNSCC肿瘤中确实上调，研究者在英国HNSCC组织队列中进行RT-qPCR验证，包括癌旁组织（n=98）和HNSCC核心肿瘤组织（n=123）。同时，利用GEPIA在线工具对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）和基因型-组织表达（Genotype-Tissue Expression, GTEx）数据库中HNSCC队列数据（n=519肿瘤 vs. n=44正常黏膜）进行交叉验证。
siRNA基因沉默逆转化疗耐药：为验证这4个基因是否为维持耐药所必需，研究者使用siRNA分别敲低TOP2A、DNMT1、INHBA和NEK2，在WT和耐药细胞中检测对相应药物的IC50（半数抑制浓度）变化。若沉默某基因能消除耐药，则耐药细胞的IC50将向WT细胞偏移，即IC50倍数差异减小。实验设立未转染组（添加转染试剂）和对照siRNA（siCtrl）作为对照，并通过RT-qPCR确认基因沉默效率。研究覆盖3株细胞系、4种药物耐药株，共12种细胞/药物组合。
泛癌种Kaplan-Meier预后生物标志meta分析：利用Oncomine和Kaplan-Meier Plotter数据库（包含54,675个基因在21种人类癌症类型中的RNA-seq转录组及生存数据），分析4个基因在不同癌种中的表达及其与预后的关联。进一步评估单个基因及基因组合的协同预后价值。
靶向INHBA和NEK2的药物库筛选与耐药逆转：以WT和顺铂耐药（cisplatin-resistant, CR）的CALH2细胞为模型，筛选包含147种已批准肿瘤药物（AOD IX）和390种天然产物（Set V）共537种化合物。通过细胞活力初筛，选出9个最有效化合物（D1–D9），其中D1–D3特异性杀伤WT细胞，D4–D6特异性杀伤CR细胞，D7–D9对两者均有杀伤作用。随后检测9个化合物对INHBA和NEK2基因表达的剂量依赖性抑制能力，最终聚焦于D4（Sirodesmin A）和D7（Carfilzomib，卡非佐米）。利用AlamarBlue细胞活力实验，检测在D4或D7单剂量（1 µM）存在下顺铂对CR细胞的IC50变化，以确定是否重新增敏。
四、主要研究结果
在转录组数据挖掘阶段，从8个独立微阵列研究的meta分析中筛选出28个在HNSCC细胞系中差异表达的基因，涉及多种癌症相关生物学过程。通过多药耐药共同基因鉴定，研究者发现TOP2A、DNMT1、INHBA和NEK2是12种细胞/药物耐药组合中最常见且上调最显著的基因。这4个基因在UK HNSCC组织队列（癌旁n=98，肿瘤n=123）中均显著上调（p×10⁻⁵），且TCGA/GTEx数据也显示HNSCC肿瘤中这四个基因表达显著高于正常黏膜（p<0.01），表明它们可作为HNSCC的分子标志物。
在siRNA沉默实验中，结果因基因和细胞系背景而异。在SVpgC2a细胞中，siTOP2A和siNEK2完全逆转了对顺铂、5FU、PTX和DTX的耐药（p<0.001），siDNMT1仅逆转PTX和DTX耐药，siINHBA仅逆转顺铂和PTX耐药。在SVFN8细胞中，siTOP2A和siNEK2同样完全逆转四种药物耐药，siDNMT1和siINHBA在所有四种耐药株中仅表现出部分逆转。在CALH2细胞中，siNEK2和siINHBA完全逆转所有四种药物耐药，而siDNMT1和siTOP2A仅部分逆转。这些结果表明NEK2在所有12种耐药细胞株中均具有关键的耐药维持作用，提示其可能是HNSCC多药耐药的核心调控基因。
泛癌种预后分析显示，4个基因在多数人类癌症中表达上调。INHBA上调与13种（87%）癌种的不良预后相关，NEK2为9种（82%），TOP2A为7种（64%），DNMT1为3种（38%）。在HNSCC中，INHBA、NEK2和TOP2A但非DNMT1的高表达与不良预后相关。综合来看，INHBA和NEK2是泛癌种中预测不良生存结局的最显著预后标志物，INHBA单独或与TOP2A、NEK2或DNMT1联合可在16/21种癌症类型中预测不良预后。
药物筛选结果发现，D4（Sirodesmin A）和D7（Carfilzomib）能以剂量依赖性方式抑制WT和CR细胞中INHBA和NEK2的表达，其IC50范围为1.1×10⁻⁸ M至6.3×10⁻⁷ M。在顺铂剂量-反应实验中，加入1 µM D4或D7可使CR CALH2细胞的顺铂IC50分别从15.10±1.59 µM降至0.52±0.12 µM（约29倍，p=1.7×10⁻⁵）和0.54±0.07 µM（约27.7倍，p=3.6×10⁻⁶），表明这两种化合物能显著重新增敏顺铂耐药细胞。顺铂剂量-反应曲线在D4或D7存在下呈双相性，提示可能存在多种顺铂耐药机制或不同细胞亚群的参与。
五、研究结论与意义
本研究首次提供了NEK2和INHBA在HNSCC细胞中赋予多药化疗耐药的证据。siRNA介导的NEK2沉默能够在所有12种耐药细胞株中完全逆转对顺铂、5FU、PTX和DTX的耐药。INHBA和TOP2A在大多数耐药株中赋予耐药，而DNMT1则表现出异质性效果。泛癌种Kaplan-Meier生存分析揭示了NEK2和INHBA在21种人类癌症中具有显著的预后价值。此外，研究发现天然真菌来源的Sirodesmin A和已批准药物Carfilzomib能够同时靶向NEK2和INHBA，并重新增敏顺铂耐药的HNSCC细胞，提示这两种药物具有重新利用以对抗化疗耐药的潜力。
该研究的科学价值在于：首次阐明了NEK2在HNSCC多药耐药中的核心作用，明确了INHBA和TOP2A在耐药中的贡献，并揭示了这些基因的泛癌种预后价值。应用价值在于：这些基因可作为个体化治疗的潜在生物标志物，用于预测HNSCC患者的化疗反应和预后；Sirodesmin A和Carfilzomib有望被重新用于联合顺铂治疗以克服耐药，从而改善HNSCC患者的治疗结局。未来需进一步阐明这些基因在肿瘤耐药中的信号传导机制及其与药物的相互作用。
六、研究亮点
本研究的亮点包括：（1）首次在HNSCC中系统鉴定并验证了NEK2和INHBA作为多药化疗耐药关键基因；（2）采用多层次的整合策略，结合转录组数据挖掘、12种耐药细胞株功能验证、临床队列验证及泛癌种预后分析；（3）利用药物库筛选发现两种可重新利用的药物，为克服顺铂耐药提供了直接的临床转化线索；（4）泛癌种分析揭示了INHBA和NEK2的广泛预后价值，拓展了其作为肿瘤生物标志物的应用前景。
七、其他有价值内容
研究还鉴定出10个多药化疗耐药候选基因（TOP2A、DNMT1、INHBA、CXCL8、NEK2、FOXO6、VIM、FOXM1B、NR3C1和BIRC5），其中部分基因此前已作为HNSCC分子诊断和口腔癌前病变风险分层的多基因组合成员。此外，研究指出INHBA编码TGF-β超家族成员，参与EGFR和RUNX2通路调控，进一步突显其在HNSCC中的重要分子靶点地位。