本研究由Wei Yang、Silvia Pires、Emre Cardakli等学者共同完成，通讯作者为Randy S. Longman，主要研究机构包括Weill Cornell Medicine的Jill Roberts炎症性肠病研究所、Memorial Sloan Kettering Cancer Center、Washington University School of Medicine以及Weill Cornell Medicine的计算生物医学研究所。该研究成果发表于国际知名免疫学期刊*Immunity*上（2026年7月8日在线发表于PMC）。
一、学术背景与研究目的
肠道黏膜免疫系统面临一项核心挑战：既要对病原体发起快速防御，又需对覆盖肠腔表面的海量共生菌维持抗原特异性耐受。在这一平衡中，表达转录因子RORγt的3型固有淋巴样细胞（group 3 innate lymphoid cell, ILC3）扮演着前线哨兵效应细胞的关键角色，其产生的白细胞介素-22（IL-22）能够促进上皮修复并恢复屏障完整性。近年来，一类同样表达RORγt的抗原呈递细胞（RORγt⁺ APC）进入研究者视野，这些细胞包括耐受性树突状细胞（tolDC）、ETAC和Thetis细胞等，它们具有在外周诱导调节性T细胞（peripherally induced regulatory T cell, pTreg）的能力，对限制肠道屏障处的炎症性T细胞反应至关重要。然而，协调组织特异性与抗原特异性免疫的细胞及分子信号在很大程度上仍不明确。
TNFSF15基因编码的TNF样蛋白1A（TL1A）是调节免疫反应的关键细胞因子，其遗传变异与炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）等慢性炎症疾病显著相关。TL1A可作用于多种细胞，在骨髓细胞中通过自分泌放大炎症，并直接刺激T细胞促进Th1和Th17反应。在肠道中，TL1A调控ILC2和ILC3的效应功能。尽管抗TL1A疗法在临床试验中展现出限制IBD炎症的潜力，但其调节组织特异性免疫的细胞与分子机制尚未被充分探索。
碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族成员e40（basic helix-loop-helix family member e40, Bhlhe40）是感染、自身免疫和炎症中一个重要的转录调节因子，但其功能具有显著的细胞和组织特异性。本研究旨在系统阐明Bhlhe40在肠道ILC3和RORγt⁺ APC中的表达调控、靶基因网络及其在协调肠道固有免疫与适应性免疫中的核心作用，填补TL1A-Bhlhe40轴在黏膜免疫中功能定位的空白。
二、研究流程与实验方法详述
研究团队构建了多维度的条件性基因敲除小鼠模型和体内外功能验证体系，整体工作流程可分为六个密切关联的环节。
首先，为定义TL1A调控的转录程序，研究者对体外TL1A刺激前后的肠道ILC3进行了RNA测序（RNA-seq）。同时，利用Bhlhe40-GFP报告基因小鼠验证稳态及TL1A刺激下Bhlhe40在肠道ILC亚群中的表达谱，并通过定量PCR（qPCR）和流式细胞术进行验证。为探究体内相关性，他们利用激动性抗DR3抗体处理小鼠、给予葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导结肠炎模型，并整合已发表的人类IBD结肠单细胞RNA-seq（scRNA-seq）数据集进行分析。此外，分选的人类结肠ILC3接受重组人TL1A刺激，以确认跨物种保守性。
第二，为探明Bhlhe40在ILC3发育和功能中的必要性，研究者使用了全身性Bhlhe40敲除（Bhlhe40⁻/⁻）小鼠和通过在Rorc-Cre驱动下敲除Bhlhe40的条件性敲除小鼠（Bhlhe40^ΔRorc），评估肠道ILC频率和数目。随后，对ILC3基线基因表达进行RNA-seq，并对Bhlhe40⁺/⁻和Bhlhe40⁻/⁻肠道ILC3在TL1A或IL-23刺激下进行转录组测序，以区分细胞因子特异性和共享的Bhlhe40依赖基因模块。流式细胞术检测了蛋白水平细胞因子产生。为揭示表观遗传机制，团队对TL1A刺激的ILC3进行了ATAC-seq（转座酶可及性染色质测序），分析了染色质可及性变化及转录因子基序富集，并联合转录组数据定位关键效应基因座位的调控。
第三，通过体内感染模型区分Bhlhe40在ILC3中的保护与致病双重角色。在依赖ILC3来源IL-22的Citrobacter rodentium感染模型中，使用Bhlhe40⁻/⁻Rag2⁻/⁻小鼠和Rorc-Cre Bhlhe40^flox/flox Rag2⁻/⁻（Bhlhe40^ΔILC3）小鼠，监测体重变化、结肠长度、组织病理学、抗菌肽转录水平和ILC3效应反应。在依赖GM-CSF的先天炎症抗CD40模型中，同样利用上述品系评价体重减轻、GM-CSF和IL-22表达，以检验Bhlhe40是否驱动致病性细胞因子程序。
第四，聚焦RORγt⁺ APC，研究者利用Bhlhe40-GFP报告小鼠确认MHCII⁺ ILC3和Prdm16⁺ APC中Bhlhe40的表达。通过Bhlhe40^ΔRorc小鼠在稳态下检测结肠RORγt⁺Foxp3⁺ pTreg和总Foxp3⁺ T细胞的比例。为了将T细胞内在效应与APC功能分离，他们构建了CD4-Cre Bhlhe40^flox/flox（Bhlhe40^ΔCD4）小鼠。抗原特异性pTreg功能评估采用过继转移模型：将naïve Helicobacter hepaticus（Hh）特异性TCR转基因CD4⁺ T细胞转移至Hh定植的Bhlhe40^ΔRorc或对照小鼠体内，两周后分析Hh特异性pTreg诱导。进一步利用CD11c-Cre Bhlhe40^flox/flox（Bhlhe40^ΔCD11c）小鼠，这些小鼠仅在RORγt⁺ APC中缺失Bhlhe40而不影响ILC3，以确认APC的特异性作用。口服耐受模型则通过向Bhlhe40^ΔRorc小鼠转移OT-II CD4⁺ T细胞后给予口服卵清蛋白（OVA），检测Foxp3⁺ OT-II细胞生成。为探究Bhlhe40缺陷在炎性环境下的后果，研究人员在Hh定植小鼠中使用抗IL-10R阻断诱导微生物驱动的结肠炎，观察内源性和转移的Th17细胞应答及组织炎症严重程度。
为阐明Bhlhe40调控RORγt⁺ APC功能的分子机制，研究者对来自2周龄Bhlhe40⁺/⁻或Bhlhe40⁻/⁻小鼠（给予抗DR3激动剂处理或不处理）的肠系膜淋巴结CD45⁺谱系阴性MHCII⁺细胞进行了scRNA-seq，对7,616个Rorc⁺细胞进行聚类和注释，分析经典ILC3、Prdm16⁺ APC和Prdm16⁻ APC的转录特征。流式细胞术和qPCR验证了MHCII、整合素αvβ8等分子的表达变化。
第五，研究OX40L在Bhlhe40依赖的免疫调控中的作用。检测Tnfsf4（编码OX40L）在TL1A刺激的Bhlhe40缺陷ILC3中的表达，并通过ATAC-seq分析Tnfsf4基因座位的染色质可及性。观察H. hepaticus定植对结肠ILC3表面OX40L表达的诱导，并在Bhlhe40⁻/⁻和Bhlhe40^ΔRorc小鼠中评估这一反应的完整性。最后，利用Rorc-Cre Tnfsf4^flox/flox（Tnfsf4^ΔRorc）小鼠，在稳态和Hh特异性pTreg转移模型中，确立ILC3来源的OX40L对pTreg生成的必需性。
三、主要研究发现与结果详解
第一环节揭示了TL1A在ILC3中特异性诱导Bhlhe40表达，且这一效应广泛存在于小鼠和人类，并与肠道炎症密切相关。RNA-seq结果显示，Bhlhe40是TL1A刺激后ILC3中上调最显著的转录因子之一。Bhlhe40-GFP报告小鼠证实，稳态下肠道ILC3、尤其是CCR6⁺亚群表达Bhlhe40，而ILC2中未检测到。体外实验进一步表明，TL1A（而非IL-1β或IL-23）能强效上调ILC3中Bhlhe40的转录本和蛋白水平，且该诱导依赖于DR3受体和MAPK信号通路。体内抗DR3激动剂处理显著提高肠道ILC3的Bhlhe40水平。DSS诱导的结肠炎增加了Bhlhe40-GFP⁺ ILC3的比例。对人类IBD scRNA-seq数据的整合分析显示，与健康对照相比，IBD患者结肠ILC3中Bhlhe40表达升高。分选的结肠人ILC3在重组TL1A刺激下同样上调Bhlhe40。这确立了Bhlhe40作为ILC3中TL1A应答及炎症相关关键因子的地位。
第二环节的转录组测序分析充分定义了Bhlhe40调控的ILC3效应程序及其表观遗传基础。Bhlhe40缺陷不影响肠道ILC发育，但导致ILC3基础状态下多种关键细胞因子（如Csf2、Tnfsf4等）表达显著降低。通过比较Bhlhe40⁺/⁻与Bhlhe40⁻/⁻ ILC3对TL1A和IL-23的反应，识别出131个Bhlhe40调控基因，其中44个主要受TL1A调控，56个受IL-23调控，31个共享。TL1A主导模块富集于炎症细胞募集和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）中心调控网络；IL-23主导模块富集于17型效应和天然激活程序。Bhlhe40在促进Il22表达的同时抑制Gzmb、Nkg7等活化相关基因，显示出一种“变阻器”式的微调功能。蛋白水平检测证实，Bhlhe40缺陷ILC3在应对IL-23、IL-1β和TL1A刺激时产生GM-CSF和IL-22的能力显著减弱。ATAC-seq分析揭示了机制层面：TL1A刺激后，开放染色质区域的AP-1基序可及性增强，而这一增强在Bhlhe40缺失时大幅削弱；对Csf2和Il22基因座位的分析直观展示了TL1A刺激且依赖Bhlhe40的染色质可及性调控。这些证据将Bhlhe40定位为协同表观遗传修饰和转录激活的上游调节器。
第三环节的体内功能实验清楚展示了Bhlhe40在ILC3中的环境依赖双向调控。在C. rodentium感染中，Bhlhe40缺陷小鼠（Bhlhe40⁻/⁻Rag2⁻/⁻和Bhlhe40^ΔILC3）表现出更严重的体重下降、结肠缩短、组织损伤和抗菌肽表达降低，且ILC3效应反应迟钝，表明Bhlhe40对于保护性IL-22依赖性黏膜防御不可或缺。恰恰相反，在抗CD40先天炎症模型中，同样的Bhlhe40缺陷小鼠体重下降减轻，且GM-CSF和IL-22表达下降，这提示在另一炎症语境下，Bhlhe40驱动了致病性效应程序。这两组实验有力地支持了Bhlhe40作为环境依赖调控因子的结论：在感染时促进保护，在特定先天炎症中促进病理。
第四环节明确了Bhlhe40在RORγt⁺ APC中对于结肠pTreg诱导的必要性。Bhlhe40^ΔRorc小鼠结肠RORγt⁺Foxp3⁺ pTreg和总Foxp3⁺细胞均减少，而Bhlhe40^ΔCD4小鼠却无pTreg变化，排除了T细胞内在效应。在Hh特异性pTreg转移模型中，Bhlhe40^ΔRorc和CD11c谱系特异性缺失的Bhlhe40^ΔCD11c小鼠均呈递极少Hh特异性pTreg，证实Bhlhe40在RORγt⁺ APC中不可或缺。口服耐受模型中，Bhlhe40^ΔRorc小鼠的OV特异性Foxp3⁺ OT-II细胞生成显著受阻。当面临Hh定植合并抗IL-10R阻断的炎症挑战时，Bhlhe40缺陷小鼠体内Hh特异性Th17细胞显著增多，内源性结肠Th17比例也上升，伴随更严重的肠道组织炎症，说明pTreg生成障碍直接导致无法约束微生物驱动的炎症性T细胞反应。单细胞转录组分析发现，Bhlhe40缺失虽未影响Prdm16⁺ APC表面MHCII、CD51或共刺激分子CD80/CD86的转录，但导致整合素β8（Itgb8）的表达下降，提示Bhlhe40通过调控Itgb8等关键分子影响APC的耐受原性功能。
第五环节揭示了ILC3来源的OX40L是Bhlhe40下游促进抗原特异性pTreg生成的重要效应机制。Tnfsf4是TL1A诱导且严格依赖Bhlhe40的靶基因；ATAC-seq亦证实Tnfsf4位点的染色质可及性受TL1A和Bhlhe40共同调控。H. hepaticus定植足以驱动结肠ILC3表面OX40L的表达，而这一诱导在Bhlhe40⁻/⁻和Bhlhe40^ΔRorc小鼠中显著受损。功能上，Tnfsf4^ΔRorc小鼠在稳态下结肠RORγt⁺Foxp3⁺ pTreg减少，且在Hh特异性转移模型中呈递的preg数量显著降低。这表明ILC3通过Bhlhe40-OX40L轴为RORγt⁺ APC介导的pTreg诱导提供关键的共刺激信号，二者协同塑造肠道抗原特异性耐受。
四、研究结论与价值
本研究首次确立转录因子Bhlhe40是联结肠道固有免疫与适应性免疫的核心协调者。在ILC3中，Bhlhe40作为TL1A信号的关键下游，通过调控AP-1相关基序的染色质可及性，整合细胞因子特异性与共享转录回路，以环境依赖的方式微调保护性（如抗感染IL-22）和致病性（如促炎GM-CSF）效应功能。在RORγt⁺ APC中，Bhlhe40是高效诱导针对肠道微生物和食物抗原的pTreg所必需的条件，并参与维持口服耐受和抑制微生物驱动的炎症。研究进一步描绘了一个精准协作模型：TL1A刺激下，ILC3上调Bhlhe40，驱动OX40L表达，为RORγt⁺ APC呈递抗原过程中的pTreg分化提供不可或缺的