CRISPR体内筛选揭示CHD7作为短效效应细胞的正向调控因子

作者及机构
本研究由哈佛医学院Blavatnik研究所的Martin W. Lafleur、Jasmin M. D’Andrea等共同完成，合作机构包括布莱根妇女医院基因免疫学与炎症研究所、麻省总医院癌症中心等。论文于2024年发表于*The Journal of Immunology*（DOI: 10.4049/jimmunol.2400213）。

学术背景
CD8+ T细胞在急性病毒感染（如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒Armstrong株，LCMV-Arm）中分化为两类亚群：记忆前体效应细胞（MPECs, memory precursor effector cells）和短效效应细胞（SLECs, short-lived effector cells）。这两类细胞表观遗传特征不同，但调控其分化的表观遗传机制尚不明确。本研究旨在通过CRISPR体内筛选，鉴定调控MPEC和SLEC分化的表观遗传因子，并揭示其对记忆T细胞形成的潜在影响。

研究流程
1. CRISPR筛选设计
- 初级筛选：使用CHIME（Chimeric Immune Editing）系统，将包含4,400个gRNA（靶向1,448个小鼠表观遗传调控基因）的文库通过慢病毒转导至Cas9表达的P14 TCR转基因小鼠的造血干细胞（LSK细胞），移植至辐照受体小鼠。感染LCMV-Arm后，分选第8天的MPEC（KLRG1− CD127+）和SLEC（KLRG1+ CD127−），以及第30天的中央记忆（CD62L+）和效应记忆（CD62L−）T细胞，通过测序分析gRNA富集情况。
- 次级筛选：基于初级筛选结果，聚焦93个候选基因，设计635个gRNA（含96个UMI条形码），直接转导初始OT-1 CD8+ T细胞，感染LCMV-Arm-OVA后分析MPEC/SLEC比例。

1. 验证实验
   
   • 基因敲除：通过电穿孔递送Cas9-gRNA核糖核蛋白（RNP）至初始OT-1或P14 CD8+ T细胞，构建CHD7敲除（KO）模型。
     
   • 竞争性转移实验：将对照与CHD7 KO T细胞以1:1比例移植至受体小鼠，感染LCMV后分析细胞比例、增殖（BrdU标记）、细胞因子分泌（IFN-γ、TNF-α）及杀伤功能（体外肿瘤细胞杀伤实验）。
     
   • 转录组与表观组分析：对分选的MPEC和SLEC进行RNA测序（RNA-seq）和染色质可及性分析（ATAC-seq）。
     

主要结果
1. CHD7促进SLEC形成
- 次级筛选中，CHD7 gRNA在MPEC中显著富集（z-score > 2），SLEC中减少（图1d-g）。竞争实验显示，CHD7 KO导致SLEC数量减少40%（图2d-f），但不影响MPEC数量（图2e）。
- 测序证实，CHD7 KO的SLEC仍保留KLGR1和CX3CR1表达（补充图4b），但早期（第6天）SLEC数量已降低（图3g），提示CHD7在分化早期发挥作用。

1. CHD7不影响细胞功能但抑制中央记忆形成

   • CHD7 KO细胞体外增殖、细胞毒性及细胞因子分泌与对照无差异（补充图2e-h），但体内增殖能力减弱（补充图3d）。
     
   • 记忆阶段（第35天），CHD7 KO细胞在脾脏中富集（图4b），且中央记忆（CD62L+ CD27hi）比例升高（图4d），但再次感染时扩增能力降低（图4f）。
     

2. 转录与表观遗传特征保留

   • RNA-seq和ATAC-seq显示，CHD7 KO的MPEC和SLEC与对照的转录谱和染色质可及性高度相似（图3a-f），仅少数基因（如代谢相关通路）差异表达（补充表III）。
     

结论与意义
本研究首次揭示CHD7通过调控早期增殖而非表观遗传重编程，促进SLEC分化并抑制中央记忆T细胞形成。其科学价值在于：
1. 阐明了CD8+ T细胞命运决定的新机制，补充了表观遗传调控网络。
2. 为优化疫苗设计（如通过靶向CHD7增强记忆反应）提供潜在靶点。

研究亮点
- 方法创新：结合双轮CRISPR体内筛选与UMI条形码技术，提高筛选严谨性。
- 发现新颖性：CHD7作为SLEC特异性调控因子，不依赖经典表观遗传重塑途径。
- 跨模型验证：在LCMV-Arm和LCMV-Arm-OVA模型中一致性验证表型。

其他价值
研究数据已公开（NCBI SRA: PRJNA844407; GEO: GSE274735/6），为后续机制研究（如CHD7下游靶点）奠定基础。