生物纳米孔技术在蛋白质测序中的工程化应用进展综述
作者与发表信息
本文由Xiaojun Wei、Tadas Penkauskas、Joseph E. Reiner等来自多所研究机构的学者合作完成，发表于*ACS Nano*期刊2023年7月刊（Volume 17, Pages 16369–16395）。
主题与背景
本文是一篇系统性综述，聚焦于生物纳米孔（biological nanopore）技术在单分子水平蛋白质测序中的最新进展。蛋白质是生命活动的核心执行者，其功能依赖于氨基酸序列及翻译后修饰（PTMs, post-translational modifications）。然而，现有蛋白质测序技术（如Edman降解和质谱法）存在通量低、动态范围有限、无法直接识别PTMs等问题。纳米孔技术因其单分子灵敏度、长读长潜力，成为突破现有技术瓶颈的重要方向。本文从工程学视角，总结了纳米孔传感器在氨基酸识别、多肽转运控制、信号解析及仪器开发等方面的研究进展，并提出了跨学科协作的优化路径。
主要观点与论据
氨基酸单分子识别策略
- 化学衍生化辅助检测：通过N端衍生化试剂（如NITC）修饰氨基酸，增大其体积并延长纳米孔停留时间，使α-溶血素（α-HL）纳米孔可区分9种氨基酸（如非极性氨基酸Gly、Ala）。实验显示，阻断电流与衍生化氨基酸的体积呈正相关（图2a）。
- 多肽载体法：通过设计带电荷的多肽载体（如七聚精氨酸R7）增强氨基酸与纳米孔（如气单胞菌溶素Aerolysin, Ael）的相互作用，成功区分13种氨基酸。静电“拉锯效应”可调控分析物在孔内的滞留时间（图2d）。
- 立体异构体识别：利用金属-有机复合物（如Cu(II)-AM7βCD）修饰α-HL纳米孔，通过手性环境差异实现对D/L型氨基酸的区分（图2f）。
多肽与蛋白质的纳米孔分析
- 质量与长度分析：Fragaceatoxin C（FraC）纳米孔通过调控pH和电解质环境，可检测4-22个氨基酸长度的多肽，且阻断电流与多肽质量线性相关（图3a）。
- 电荷异质性多肽的转运控制：Ael纳米孔突变体（如N226Q/S228K）通过引入额外静电收缩区，显著提升带异质电荷多肽的捕获效率（图3f）。
- 翻译后修饰（PTMs）检测：FraC纳米孔无需标记即可区分磷酸化与O-糖基化修饰（图3g）；Ael纳米孔突变体（T232K/K238Q）通过延长磷酸化tau肽的滞留时间，实现近100%的修饰位点鉴定准确率。
多肽转运的工程化调控
- 酶马达驱动测序：DNA解旋酶（Helicase）推动DNA-多肽复合物通过MspA纳米孔，实现多肽的逐步转运（图4a）。
- 相位移动测序技术（NIPSS）：通过phi29 DNA聚合酶调控肽-寡核苷酸复合物（POC）的“棘轮运动”，可检测单氨基酸替换（图4b）。
- 多重读取策略：结合DNA重读技术，对同一多肽分子多次测序可将单次准确率从87%提升至>99.999%（图4c）。
人工智能与分子模拟的辅助作用
- 机器学习算法：随机森林模型对氨基酸识别的准确率达99.6%；深度学习（如LSTM网络）可处理复杂电流信号，实现多肽序列分类。
- 分子动力学（MD）模拟：全原子模型揭示了肽段转运与电流阻断的分子机制（图5b），而多尺度模型（如Martini力场）可模拟蛋白质-纳米孔组装的平衡态特性（图5c）。
仪器开发与噪声控制
- CMOS集成放大器：通过降低输入电容和优化滤波电路，将检测带宽扩展至MHz级别，提升信噪比（图5e-f）。
- 光学-电学联用技术：等离子体纳米结构增强的荧光共振能量转移（FRET）和表面增强拉曼光谱（SERS）可辅助分子识别。
科学意义与价值
本文系统梳理了生物纳米孔蛋白质测序的技术路线与挑战，强调了跨学科协作（化学修饰、蛋白质工程、分子模拟、机器学习、电子器件）的必要性。其科学价值在于：
1. 方法论创新：提出多种氨基酸识别与多肽控制转运策略，为单分子蛋白质测序奠定基础。
2. 技术整合：将纳米孔传感与AI、微流控、光学技术结合，推动高通量、高精度测序仪开发。
3. 应用潜力：在疾病标志物检测、蛋白质组学、个性化医疗等领域具有转化前景。
亮点与挑战
- 亮点：
- 首次综述了从氨基酸识别到完整蛋白质测序的全链条技术；
- 提出“工程化纳米孔”概念，涵盖孔道设计、信号解析、仪器优化三大维度；
- 突破性成果如Ael纳米孔对PTMs的定位检测、DNA重读技术的高准确率。
- 挑战：
- 20种氨基酸的普适性识别仍待解决；
- 天然多肽的电荷异质性导致转运控制困难；
- 大规模蛋白质组的测序通量需进一步提升。
本文为纳米孔蛋白质测序领域提供了全面的技术路线图，其工程化思维与跨学科框架对后续研究具有重要指导意义。