本研究由香港理工大学应用生物及化学科技学系等机构的Qi Liu、Di Suo、Renxian Wang等多位研究人员完成，发表于《Lab on a Chip》期刊（2026年，第26卷，1996–2011页），论文标题为《Bone-on-leaf-chip for the study of lung cancer bone metastasis》（用于研究肺癌骨转移的骨-叶片芯片）。该研究属于器官芯片（organ-on-a-chip）与肿瘤转移机制研究领域，核心目的是利用一种基于叶脉结构的微流控芯片平台，构建可灌注的血管化骨微环境，从而在体外研究肺癌细胞在骨中的休眠与侵袭行为。
研究背景与目的
肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，骨是其最常见的转移部位。肿瘤转移占癌症相关死亡的90%以上，而目前针对转移性疾病的治疗手段仍然十分有限。经典的“种子与土壤”假说认为，原发肿瘤细胞（种子）倾向于在有利于其定植的特定器官微环境（土壤）中生长。骨微环境由多种细胞类型（如成骨细胞、破骨细胞、骨细胞）和信号分子（如骨形态发生蛋白BMPs、转化生长因子TGF-βs）及细胞因子（如白介素ILs、肿瘤坏死因子TNF-α）组成，这些成分共同调控转移性肿瘤细胞的休眠、逃逸和侵袭。然而，传统的二维细胞培养和动物模型在模拟人类骨微环境的生理条件和动态力学刺激方面存在明显不足。现有的器官芯片系统大多采用简单的平行通道设计，无法准确重现骨组织高度血管化且多尺度的血管网络结构，因而在模拟营养物质交换、氧气递送及细胞迁移方面受到限制。为此，研究团队基于前期工作，提出利用叶片叶脉（leaf vein）结构构建具有分层流动分布和均匀剪切力的微流控芯片，并在其中整合骨微环境腔室，以更真实地模拟生理条件下肿瘤细胞迁移、休眠及再激活的过程。研究目标并不是完整重现整个转移级联过程，而是利用该平台作为可控的体外微环境，定量研究流动和内皮相互作用对肿瘤细胞行为的影响。
研究方法与流程
研究首先设计并制备了叶脉芯片。芯片通过AutoCAD软件对原有叶脉图案进行改造，加入了直形或Y形入口、出口和六个直径2毫米的腔室。利用SU-8光刻技术在硅片上制作深度为150微米的模具，随后以聚二甲基硅氧烷（PDMS）倒模形成芯片主体，并用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）上下夹层和螺丝固定，形成密封的微流控系统。腔室用于装载三维纤维蛋白水凝胶（fibrin hydrogel），以模拟骨组织空间。
为表征芯片性能，研究团队进行了染料灌注实验、FITC-葡聚糖（FITC-dextran）扩散实验和粒子图像测速（PIV）分析。结果显示，蓝色和红色染料能够分别通过两个入口均匀填充整个芯片或实现“半对半”灌注模式，证明芯片支持双条件培养。FITC-葡聚糖在灌注60分钟后，腔室和通道的荧光强度趋于一致，说明水凝胶内的细胞可获得有效的营养物质交换。利用Ansys Fluent软件进行的计算流体动力学（CFD）模拟显示，芯片内流速分布稳定，压力从入口到出口逐渐降低且左右对称，水凝胶的存在对压力分布无显著影响。PIV实验进一步比较了无分支、单分支、三分支、网格和叶脉五种结构。结果显示，叶脉芯片的最大流速为0.25 mm/s、平均流速为0.10 mm/s，速度场均匀，且腔室内速度变异系数为27.38%，优于无分支、单分支和网格结构。荧光微珠灌注实验还发现，叶脉结构具有选择性的“过滤”效应——进入腔室的微珠数量少于单分支结构，提示该结构可能有助于筛选进入骨微环境的肿瘤细胞。
芯片内血管网络的构建分为两步。首先将绿色荧光蛋白标记的人脐静脉内皮细胞（GFP-HUVECs）以1×10⁷ cells/mL的密度包封于纤维蛋白水凝胶中并注入腔室。培养三天后，内皮细胞在腔室内自组装形成三维分支微血管网络。随后将红色荧光蛋白标记的HUVECs（RFP-HUVECs）注入通道，经多次翻转注射和四小时贴壁后，以20 μL/min的流速灌注培养两天，使通道内壁形成完整内皮层。CD31和F-actin免疫荧光染色证实血管网络存在管腔结构，VE-cadherin染色显示内皮完整性良好。在剪切力刺激下，内皮细胞中KLF2表达高于静态培养条件，表明流动促进了内皮细胞活化。
为模拟不同的骨微环境，研究构建了两种细胞组合：一种是HUVECs与人骨髓基质细胞HS-5共培养，代表“休眠微环境”（dormancy niche）；另一种是HUVECs与M0型THP-1巨噬样细胞共培养，代表“恶性循环微环境”（vicious cycle niche）。在芯片内，两种微环境均能形成血管化结构，且细胞活性良好。为模拟原发肿瘤对骨微环境的影响，研究使用A549肺癌细胞的条件培养基（conditioned medium, CM）预处理骨微环境。随后在芯片培养第9天，将绿色荧光蛋白标记的A549细胞以2×10⁶ cells/mL的密度灌注进入腔室，并以正常培养基（ECM:DMEM=1:1）或实验培养基（ECM:CM=1:1）持续灌注5天。
主要结果
在休眠研究方面，芯片外Transwell细胞周期实验显示，A549细胞与HUVECs和HS-5共培养后，处于G0/G1期的比例由38%上升至60%，表明细胞进入休眠状态；而CM处理后，G0/G1期比例降至40%，说明休眠被打破。芯片内Ki67染色结果与此一致：正常培养基组Ki67阳性率约22%，而CM处理组上升至55%。这表明HS-5和HUVEC构成的骨微环境成功诱导A549细胞休眠，而CM可使其重新激活。
人类细胞因子阵列分析显示，在休眠模型中，CM处理组血管生成素（angiogenin）、巨噬细胞炎性蛋白-3α（MIP-3α）和骨桥蛋白（OPN）表达升高，CCL7表达降低。RT-qPCR进一步证实，CM处理上调了BMP-1、Wnt-5a、MIP-3α和TGF-β2的基因表达。这些因子与血管生成、促炎通路和上皮-间充质转化（EMT）相关，提示肿瘤分泌因子可能通过激活这些通路促进休眠肿瘤细胞再激活。
在侵袭研究方面，CM处理组A549细胞在第14天表现出明显的细胞伸长和突触形成，皮质肌动蛋白（cortactin）荧光强度显著高于正常培养基组。Cortactin是侵袭伪足（invadopodia）形成的标志物，其上调提示细胞侵袭能力增强。细胞因子阵列显示，CM处理组CCL5、CXCL5、血管生成素和OPN表达升高。RT-qPCR结果显示，CM处理上调了CTSK、MMP-9、CCL5和VCAM-1的基因表达。CTSK和MMP-9是与破骨细胞分化和骨基质降解相关的基因，CCL5和VCAM-1则参与白细胞募集和肿瘤侵袭。这些结果说明CM改造了骨微环境，促进了A549细胞的侵袭行为。
结论与价值
本研究成功构建了叶脉芯片并在其中建立了两种血管化骨微环境，证明该平台能够在体外模拟肿瘤休眠与侵袭等骨转移核心特征。研究还揭示了CM通过对休眠和侵袭相关细胞因子及基因的调控，分别驱动肿瘤细胞从休眠状态向再激活转变，以及促进肿瘤侵袭的潜在机制。该平台在个性化诊断、药物筛选和针对骨转移微环境的治疗策略开发方面具有广阔的应用前景。与现有平行通道芯片相比，叶脉芯片的分层结构和均匀流动特性更接近真实骨组织的血管网络特征，为研究肿瘤细胞迁移、休眠和再激活提供了更生理相关的体外工具。
研究亮点
该研究的亮点在于：第一，利用叶脉仿生结构构建了具有分层流动分布和均匀剪切力的血管化微流控芯片，提升了体外骨转移模型的结构仿真度；第二，在同一芯片内实现了两种不同骨微环境（休眠与恶性循环）的独立构建和比较分析；第三，通过CM处理模拟了原发肿瘤对远端骨微环境的改造，并结合细胞因子阵列、RT-qPCR和免疫荧光等多种手段系统揭示了肿瘤-微环境相互作用的分子机制；第四，全部采用人源细胞，避免了跨物种差异对基因表达分析的干扰。不过，该研究也指出，关于骨微环境重构和免疫细胞募集的结论主要基于间接的细胞因子和基因表达证据，仍需通过实时成像和结构分析进一步验证。未来可通过siRNA基因沉默和患者来源细胞开展更深入的机制研究和药物测试。