一、 研究作者与发表情况
本研究由广州市医科大学附属清远医院（清远市人民医院）检验科的徐腾（Xu Teng）博士、梁雅茹（Yaru Liang）教授和李林海（Linhai Li）教授作为通讯作者，并联合该院桂凌燕（Lingyan Gui）、梁卫源（Weiyuan Liang）以及成都第三人民医院刘涛（Tao Liu）、赣南医学院陈九洋（Jiuyang Chen）、刘玥（Yue Liu）等多位研究者共同完成。研究论文题目为《基于距离驱动化学发光技术的高效免分离、免洗涤免疫分析用于生物标志物的灵敏检测》。该研究发表在美国化学会旗下权威期刊《Analytical Chemistry》上，发表日期为2025年3月20日，具体卷期为2025年第97卷第6661-6669页。
二、 学术背景与研究目的
本研究隶属于分析化学与临床检验医学的交叉领域，具体聚焦于化学发光（Chemiluminescent, CL）免疫分析技术的革新。化学发光免疫分析因其结合了免疫反应的高特异性和化学发光检测的高灵敏度，已成为临床、制药和生化分析中检测生物标志物（如蛋白质、激素）的主流技术。然而，传统的异相化学发光免疫分析通常依赖于固相载体（如磁珠、微孔板）来实现抗原-抗体复合物与游离组分的分离，并在反应后需要进行洗涤步骤以去除未结合的探针，从而降低背景信号。尽管这些步骤对于保证高灵敏度至关重要，但它们也带来了显著的局限性：耗时、操作复杂、对实验人员技能要求高，并可能因洗涤不彻底或操作差异导致信号不稳定，成为实现快速、高通量、自动化临床检测的主要障碍。因此，开发一种既能保持高灵敏度与高选择性，又能实现免分离、免洗涤的化学发光免疫新方法，具有迫切的临床需求和应用价值。
此前，简化操作的策略主要包括基于上清液检测和基于发光氧通道（Luminescent Oxygen Channeling）的技术。前者仍需磁分离步骤，后者则需激光激发以产生单线态氧，这不仅引入了光源和背景光干扰，也丧失了传统化学发光技术无光源、背景低的固有优势。因此，设计一种真正免分离、免洗涤、无需外部光源且高灵敏的化学发光免疫分析新策略仍然是一个挑战。
基于此背景，本研究旨在受发光氧通道技术原理启发，创新性地提出一种“距离驱动化学发光技术”，并以此为基础开发一种全新的免分离、免洗涤免疫分析平台。该平台的核心是利用具有类过氧化物酶活性的金钴金属纳米簇（Au−Co Nanoclusters, NCS）催化产生活性氧物种（ROS），并通过在抗原存在下形成的“三明治型”免疫复合物，精确控制化学发光分子与催化纳米簇之间的距离，从而实现信号的“开关”控制与定量检测。研究以临床重要炎症标志物C反应蛋白（CRP）为模型分析物，旨在验证该方法的可行性、分析性能及其在实际血清样本检测中的应用价值。
三、 详细研究流程
本研究的工作流程系统而严谨，主要包括以下几个关键步骤：
1. Au−Co 金属纳米簇的合成与表征 研究者首先以L-还原型谷胱甘肽（GSH）为还原剂和保护剂，合成了不同金钴摩尔比（Au/Co = 8， 4， 2）的Au−Co纳米簇。研究过程包括详细的材料制备（详见支持信息）。随后，他们利用高分辨透射电子显微镜（HR-TEM）对纳米簇的形貌和尺寸进行了表征。结果显示，最优的Au/Co摩尔比为4的纳米簇呈球形，分散性良好，平均尺寸约为2.91纳米，晶格间距为0.24纳米，对应于面心立方金的（111）晶面。X射线衍射（XRD）谱图未显示明显的金晶体衍射峰，证实了其为纳米簇而非较大尺寸的纳米颗粒。紫外-可见吸收光谱在550纳米附近无表面等离子体共振吸收峰，进一步排除了大粒径金纳米粒子的存在。傅里叶变换红外光谱（FTIR）显示，与游离GSH相比，Au−Co纳米簇的S-H伸缩振动峰消失，表明GSH通过Au-S共价键成功修饰在纳米簇表面。X射线光电子能谱（XPS）分析揭示了Au元素主要以Au(0)和Au(I)态存在，Co元素则以单质态和氧化态共存，证实了Au−Co核壳结构纳米簇的成功合成。
2. Au−Co 纳米簇的化学发光性能与催化机理研究 为了评估所合成纳米簇的催化性能，研究者将其引入到经典的鲁米诺（luminol）-过氧化氢（H₂O₂）化学发光体系中进行测试。实验使用静态注射装置（见图S1），将稀释后的Au−Co纳米簇、鲁米诺、NaOH和H₂O₂按顺序混合，通过光电倍增管（PMT）监测发光信号。结果发现，Au−Co纳米簇能够显著增强鲁米诺-H₂O₂体系的化学发光信号，强度比不含纳米簇的空白体系高出约100倍。对照实验表明，单独的GSH或HAuCl₄与CoCl₂的混合物均无法产生如此显著的增强效果，证明增强效应源于Au−Co纳米簇本身。 为了阐明催化机理，研究者进行了多项验证实验。首先，化学发光光谱显示最大发射波长在425纳米，与激发态3-氨基邻苯二甲酸酯的发射一致，表明信号来源于鲁米诺的氧化。反应后的XPS分析表明纳米簇的表面元素组成未发生改变，说明其作为催化剂而非能量受体参与反应。其次，使用3,3‘，5，5’-四甲基联苯胺（TMB）显色试剂盒验证了Au−Co纳米簇具有类过氧化物酶活性，且活性与纳米簇浓度正相关。最关键的是，通过向反应体系中添加不同的活性氧清除剂（如硫脲清除羟基自由基•OH、对苯醌清除超氧阴离子自由基O₂•⁻、叠氮化钠清除单线态氧¹O₂、抗坏血酸广谱清除ROS），研究者发现•OH和O₂•⁻的清除能显著抑制化学发光信号，而¹O₂的清除影响甚微。由此得出结论：Au−Co纳米簇通过其类过氧化物酶活性催化分解H₂O₂，主要产生•OH和O₂•⁻，这些活性氧进而氧化鲁米诺产生强烈的化学发光。这一发现为后续构建“距离驱动”机制提供了理论基础：即催化产生的ROS必须与发光分子近距离接触才能引发反应。
3. 基于距离驱动化学发光技术的免疫分析构建与优化 这是本研究的核心创新部分。研究策略是：将捕获抗体标记在Au−Co纳米簇上（Ab₂-AuCo NCS），将检测抗体标记在鲁米诺类似物ABEI上（Ab₁-ABEI）。当目标抗原（CRP）存在时，会形成“三明治型”免疫复合物（CRP/Ab₁-ABEI/Ab₂-AuCo NCS），从而将ABEI发光分子拉近至催化纳米簇附近。加入H₂O₂后，纳米簇催化产生的ROS可以高效氧化邻近的ABEI，产生强化学发光信号。若抗原不存在，则Ab₁-ABEI和Ab₂-AuCo NCS自由分散在溶液中，平均距离较远，ROS在到达ABEI前已淬灭，因此背景信号很低。 构建过程中，研究者对多个参数进行了系统优化： * 纳米簇筛选与稀释比优化：比较了不同Au/Co摩尔比纳米簇的催化性能。虽然Au/Co=2的纳米簇催化产生的本底信号最强，但其易于聚集沉淀。最终选择性能平衡、稳定性好的Au/Co=4的纳米簇，并确定了其最佳稀释比例，以避免纳米簇自身浓度过高对发射光的吸收（内滤效应）。 * 反应条件优化：确定了化学发光反应的最佳pH值为12（通过添加NaOH调节），以及PMT的最佳工作电压为-1100V以获得更高灵敏度。 * 标记分子选择：对比了鲁米诺和ABEI。由于鲁米诺氨基端与芳香环距离较短，与抗体偶联后可能因空间位阻或电子效应导致发光效率降低。而ABEI具有可修饰的伯氨基，更适合作为抗体标记的发光底物，因此被选用。 * 抗体标记验证：通过Zeta电位、粒径分析和紫外光谱证实了抗体成功标记到Au−Co纳米簇和ABEI上。 * 免疫复合物形成条件优化：通过实验确定了最佳孵育时间（第一阶段40分钟，第二阶段30分钟）和抗体使用浓度（均为50 μg/mL）。 * “距离驱动”原理验证：这是关键验证实验。研究者使用层状双氢氧化物（LDHS）作为抗体吸附材料来人为改变Ab₁-ABEI和Ab₂-AuCo NCS之间的距离。实验表明，当两者自由混合时，信号微弱；加入LDHS吸附两者使其彼此靠近后，化学发光信号显著增强。这直接证明了缩小发光分子与催化剂之间的距离是信号增强的根本原因。此外，通过将形成的免疫复合物溶液进行系列稀释，发现随着稀释倍数增加（即复合物间平均距离增大），检测信号下降，而高稀释度（1000倍）下体系对CRP的检测灵敏度最高，说明此稀释度下背景（未形成复合物的游离抗体对）信号被有效抑制，而抗原依赖的特异性信号得以凸显。
4. 分析性能评估与实际样本应用 在最优条件下，研究者对所构建的免疫分析方法的性能进行了全面评估。 * 灵敏度与线性范围：以CRP为分析物，在0.003至30 μg/mL的浓度范围内，化学发光强度与CRP浓度的对数呈现良好的线性关系，拟合方程为Y = 47.9322 lgX + 294.5570 （R² = 0.9903）。方法的检出限（信噪比S/N=3）低至0.7 ng/mL。与文献中已报道的多种CRP检测方法相比，本方法表现出可比甚至更优的灵敏度。 * 选择性：考察了可能共存的干扰物质，包括尿酸（UA）、胆红素（BIL）、血红蛋白（HB）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）和胆固醇（CHOL）。结果表明，即使在较高浓度下，这些物质均不能引起显著的化学发光响应，只有CRP能产生强信号。这归功于所用抗体（M6911和M6914）对CRP的高特异性识别。 * 稳定性与重现性：Au−Co纳米簇标记的抗体在储存期间表现稳定，用于检测的RSD小于1.29%。对同一浓度CRP样本进行日内和日间重复测定，RSD分别为1.20%（7次，1天内）和1.95%（5次，20天后），表明方法具有良好的重现性和长期稳定性。 * 实际血清样本检测：为评估临床适用性，研究从广州医科大学附属清远医院获取了真实人血清样本（经伦理委员会批准）。样本仅经过简单稀释处理后，即用本方法进行检测，并与医院采用的临床检测方法（金标准）的结果进行比对。结果显示，本方法的测定值与临床方法结果高度一致，加标回收率在96.55%至106.29%之间，相对标准偏差较低，充分证明了该方法在实际复杂样本检测中的准确性和可靠性。
四、 主要研究结果及其逻辑关联
本研究取得了一系列环环相扣、支撑核心结论的研究结果： 1. 成功合成并表征了高性能Au−Co纳米簇：HR-TEM、XRD、XPS等数据证实了尺寸均一、结构明确的Au−Co纳米簇的成功制备，这是后续所有催化功能和标记应用的基础。 2. 揭示了Au−Co纳米簇的类过氧化物酶活性及催化产生ROS的机制：化学发光增强实验、TMB显色实验以及ROS清除剂实验共同证明，Au−Co纳米簇能高效催化H₂O₂分解产生•OH和O₂•⁻，这是驱动化学发光反应的动力源。此结果直接引出了利用ROS进行信号传导的构想。 3. 验证了“距离驱动”化学发光原理的可行性：LDHS吸附实验和免疫复合物稀释实验提供了决定性证据。前者直接操控距离并观测到信号的“开关”效应；后者通过稀释改变复合物间距，观察到了信号随距离增大而衰减的现象，并找到了信背比最优的检测条件。这些结果构成了整个免疫分析方法的设计核心和理论支柱。 4. 建立了高灵敏、高选择性的CRP检测方法：在优化条件下，该方法对CRP展现出宽线性范围和低检测限。高选择性结果验证了在复杂基质中特异性检测的能力。这些性能数据是将该方法从概念验证推向实际应用的关键。 5. 证明了方法在真实临床样本中的准确性与实用性：血清样本检测结果与临床标准方法的高度吻合及良好的回收率，是该方法最终价值的最有力证明，表明其能够满足临床检验的要求。
每一阶段的结果都为下一阶段的研究提供了依据和支持：纳米簇的合成与催化机理研究为方法构建提供了材料基础和理论指导；“距离驱动”原理的验证为免疫分析模式的设计提供了创新思路；最终的分析性能与样本验证则全面评估了该创新方法的实际应用潜力。
五、 研究结论与价值
本研究成功首次构建了一种基于距离驱动化学发光技术的高效、免分离、免洗涤免疫分析新方法。该方法利用自研的Au−Co金属纳米簇作为高性能类过氧化物酶催化剂，并通过抗原引导形成“三明治型”免疫复合物来精确调控催化剂与发光分子（ABEI）之间的空间距离，从而实现对目标生物标志物的灵敏、特异检测。 其科学价值在于：提出并验证了一种全新的化学发光信号调控机制——“距离驱动”，这不同于传统的空间位阻、能量转移或催化活性直接标记等策略，为均相或准均相免疫分析的设计提供了新颖的理论框架和通用的技术平台。所开发的Au−Co纳米簇作为稳定、高效的纳米酶，丰富了纳米酶在生物传感领域的工具箱。 其应用价值巨大：该方法彻底摒弃了传统异相免疫分析中繁琐的分离和洗涤步骤，极大地简化了操作流程，缩短了检测时间，降低了对操作人员和仪器的要求，同时保持了高灵敏度与高选择性。这使其特别适合于开发自动化、高通量的临床免疫分析系统，以及在现场快速检测（POCT）和体外诊断（IVD）领域的应用。以CRP检测为例的成功示范，为该方法推广至其他蛋白质、核酸等生物标志物的检测奠定了坚实基础。
六、 研究亮点
七、 其他有价值内容
研究中对实验细节的充分展示和深入机理探讨增强了工作的可信度和深度。例如，系统研究了纳米簇组成、稀释比例、pH值等因素对信号的影响，并详细解释了信号先增后降等现象背后的原因（如内滤效应）。支持信息中提供了完整的实验细节、对照数据和对比表格，使得研究工作非常扎实和透明。此外，论文在结论部分展望了该距离驱动化学发光技术在环境保护、药物分析等其他领域的拓展应用潜力，显示了该技术平台的广泛适用性。