肝癌治疗新突破：CRISPR筛选揭示SF3B4剪接因子与铁死亡抵抗的关键作用

作者及发表信息
本研究由香港中文大学外科系Yue Guo、Mingjing Xu、Nathalie Wong等团队主导，联合澳门大学、香港中文大学再生医学教育部重点实验室等机构合作完成，成果于2025年10月10日发表于*Science Advances*（Guo et al., Sci. Adv. 11, eadw7181）。

学术背景
肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是全球癌症相关死亡的主因之一，晚期患者依赖酪氨酸激酶抑制剂乐伐替尼（lenvatinib）等系统治疗，但耐药性成为临床难题。尽管基因组测序已鉴定大量HCC相关基因，但其功能验证仍面临挑战。本研究通过全基因组CRISPR-Cas9敲除（KO）筛选，聚焦两个核心问题：（1）HCC细胞存活必需的基因；（2）乐伐替尼耐药的调控机制。研究利用患者来源类器官（Patient-Derived Organoids, PDOs）模型，首次揭示了剪接因子SF3B4（Splicing Factor 3B Subunit 4）驱动肝癌发生及铁死亡（ferroptosis）抵抗的分子机制。

研究流程与方法
1. CRISPR筛选与类器官模型构建
- 样本与模型：从患者HCC组织直接培养PDO（H813Torg），保留原发肿瘤的组织病理学特征及关键驱动突变（如TP53 R175H、PTEN C228T）。
- 筛选设计：使用人类GeCKO v2文库（靶向19,050个基因，每个基因3条sgRNA），在PDO中分两组筛选：生存必需基因（无药物处理）和乐伐替尼耐药基因（30 μM药物处理）。感染复数（MOI）控制在0.4，确保80%细胞仅接收单一sgRNA。通过下一代测序分析sgRNA丰度变化，结合MAGeCK算法和稳健秩聚合（RRA）方法鉴定显著负选择基因。

1. SF3B4的功能验证

   • 体内外实验：
     
     • 体外：SF3B4敲除导致HCC类器官（H813Torg、H688Torg）自发凋亡；过表达SF3B4则诱导正常肝类器官（Liver.org1/2）形态恶性转化（多层厚壁结构）并延长体外存活时间（>35周 vs 对照组18周）。
       
     • 体内：采用水动力尾静脉注射（HDTVI）小鼠模型，SF3B4过表达使肝癌发生率从50%提升至100%，肿瘤体积显著增大。
       
   • 分子机制：
     
     • RNA免疫共沉淀测序（RIP-seq）：发现SF3B4结合区域集中于内含子（36.02%）和3’非翻译区（29.03%）。
       
     • 长读长异构体测序（Iso-seq）：SF3B4调控外显子跳跃（40.98%）或保留（31.26%），显著影响转录因子异构体生成，如TBX3+2a（外显子2a包含型）。
       
     • 剪接调控：反义寡核苷酸（ASO）阻断SF3B4与TBX3前体mRNA结合后，TBX3+2a表达下降，证实其依赖SF3B4的剪接调控。
       

2. 乐伐替尼耐药机制解析

   • CRISPR筛选：耐药组中，铁死亡抑制基因（如GCLC、Furin、NQO1）显著富集。GCLC（谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基）敲除使耐药类器官IC50降低，恢复乐伐替尼敏感性。
     
   • 反馈机制：乐伐替尼剂量依赖性上调GCLC表达，激活抗铁死亡通路（如SLC7A11、CHAC1）。联合铁死亡诱导剂（IKE或BSO）可逆转耐药性。
     

主要结果与逻辑关联
- SF3B4的致癌作用：CRISPR筛选排名前30%的必需基因中，29个为剪接体组分；SF3B4在60% HCC病例中高表达，且与患者不良预后相关。其通过剪接调控TBX3+2a，促进干细胞特征（SOX9、EPCAM上调）和肿瘤增殖（Ki67增加）。
- 耐药机制：GCLC介导的谷胱甘肽合成通路抑制铁死亡，是乐伐替尼耐药的核心。SF3B4敲除通过激活铁死亡增强药物敏感性，揭示二者功能关联。

结论与价值
1. 科学价值：首次在PDO中完成全基因组CRISPR筛选，确立SF3B4-TBX3+2a轴为HCC新靶点，并阐明剪接异常驱动肿瘤发生的机制。
2. 应用潜力：
- 治疗策略：SF3B复合物抑制剂H3B-8800单用或联合乐伐替尼显著抑制肿瘤生长；靶向GCLC的铁死亡诱导剂可克服耐药。
- 临床转化：PDO模型的高保真性为个体化治疗提供平台，如基于SF3B4/GCLC表达的联合用药方案。

研究亮点
1. 技术创新：
- 首创“类器官-CRISPR筛选”体系，克服传统细胞系的局限性。
- 结合Iso-seq与短读长转录组（Hybrid RNA-seq），精准解析剪接异构体。
2. 发现新颖性：
- SF3B4通过非经典剪接调控TBX3+2a，链接剪接异常与肝癌干性。
- 揭示乐伐替尼耐药的铁死亡逃避机制，提出“代谢-表观遗传”协同靶向策略。

其他价值
研究数据已公开于欧洲基因组表型组存档库（EGA: EGAD50000001240），为后续研究提供资源。此外，PDO模型的遗传稳定性验证（如TP53突变保留）为癌症机制研究树立新标准。