学术研究报告：基于纳米高效液相色谱-高分辨质谱（nano-HPLC-HRMS）的羊血浆中内源性GnRH定量方法开发及验证

作者及机构
本研究由意大利都灵大学分子生物技术与健康科学系的Enrica Mecarelli、Riccardo Aigotti、Alberto Asteggiano、Federica Dal Bello和Claudio Medana领衔，联合法国里尔大学（University Lille）的Paolo Giacobini、法国图尔大学（University of Tours）的Manon Chasles和Yves Tillet共同完成。研究成果于2022年9月5日在线发表于《Analytical and Bioanalytical Chemistry》（2022年卷414期，页码7623–7634）。

学术背景

研究领域与动机
促性腺激素释放激素（Gonadotropin-Releasing Hormone, GnRH）是一种神经十肽，在脊椎动物生殖系统的发育和维持中起核心调控作用。其异常释放与多种生殖疾病相关，如低促性腺激素性性腺功能减退症、多囊卵巢综合征（PCOS）及产前雄激素暴露（PNA）等。然而，GnRH在外周循环中的浓度极低（皮克/毫升级），且半衰期短，传统免疫分析法（如放射免疫测定RIA）易受交叉反应干扰，导致定量结果不一致。因此，开发高灵敏度、高特异性的GnRH定量方法对生殖病理机制研究和临床诊断具有重要意义。

研究目标
本研究旨在建立并验证一种基于纳米高效液相色谱-高分辨质谱（nano-HPLC-HRMS）的技术，用于羊血浆中内源性GnRH的精准定量，并通过验证流程评估其在复杂生物基质中的适用性。

研究方法与流程

1. 样本制备与预处理

• 研究对象：
  
  • 健康母羊（n=8）与产前雄激素暴露（PNA）母羊（n=8）的血浆样本。
    
  • 人类血浆（作为验证对照，10批次，GnRH未检出）。
    
• 预处理步骤：
  
  • 蛋白质沉淀：250 μL血浆中加入400 μL冷乙腈/甲酸混合液，-20°C孵育15分钟，离心（15,000 g, 20分钟）去除高丰度蛋白。
    
  • 固相萃取（SPE）：上清液冻干后复溶于含3%乙酸/1%三氟乙酸（TFA）的溶液，通过Strata-X反相柱净化，洗脱液冻干后复溶于0.1%甲酸水溶液。
    

2. 仪器分析与条件优化

• 色谱分离：
  
  • 使用PepMap™ RPLC C18纳米柱（75 μm×50 cm），流动相为0.1%甲酸水（A）和0.1%甲酸乙腈/水（8:2, B），梯度洗脱45分钟。
    
• 质谱检测：
  
  • 高分辨Orbitrap Fusion质谱仪，正离子模式，全扫描范围m/z 300–2000（分辨率60,000），MS/MS扫描（分辨率30,000）。
    
  • GnRH（m/z 591.7938, z=2）和内标L-LHRH-III（m/z 630.2889, z=2）通过CID碎裂，选择y5、y7、b8片段离子定量。
    

3. 方法验证

• 替代基质（Surrogate Matrix）策略：
  
  • 采用人工基质（SigMatrix血清稀释剂）建立校准曲线（0.08–30 ng/mL），并与人类血浆验证结果对比（斜率差异7.7%）。
    
• 关键参数：
  
  • 灵敏度：检出限（LOD）0.008 ng/mL，定量限（LOQ）0.024 ng/mL。
    
  • 准确度与精密度：日内/日间偏差<26.3%，符合ICH/FDA指南（<30%）。
    
  • 回收率与基质效应：平均回收率73.4%，基质效应70.0%。
    

主要结果

1. 方法性能：

   • 纳米HPLC-HRMS成功区分GnRH与内标，保留时间重复性（RSD<1.59%）。
     
   • 在羊血浆中，GnRH浓度范围为0.05–3.26 ng/mL，PNA组（1.07 ng/mL）显著高于对照组（0.19 ng/mL）。
     

2. 生物学意义：

   • PNA母羊的GnRH与黄体生成素（LH）水平呈正相关（r=0.89），支持产前雄激素暴露导致成年后GnRH分泌紊乱的假说。
     

结论与价值

科学意义：
- 首次建立了一种高灵敏度的nano-HPLC-HRMS方法，解决了内源性GnRH在复杂基质中定量难题。
- 验证了替代基质策略的可靠性，为其他低丰度肽类定量研究提供范式。

应用价值：
- 为生殖疾病（如PCOS）的机制研究和诊断标志物开发奠定技术基础。
- 可扩展至其他物种（如人类）及基质（脑脊液、组织匀浆）的GnRH检测。

研究亮点

1. 技术创新：

   • 结合纳米色谱与高分辨质谱，将检测灵敏度提升至皮克级，优于传统RIA。
     
   • 开发了适用于GnRH的SPE净化流程，显著降低基质干扰。
     

2. 跨学科贡献：

   • 为神经内分泌学与临床化学提供了工具支持，推动精准医学发展。
     

3. 动物模型验证：

   • 在PNA母羊中首次证实GnRH水平与LH的关联性，为PCOS动物模型研究提供新证据。
     

其他价值
- 研究数据已公开，支持后续多中心验证（ERC资助项目725149/REPRODAMH）。
- 方法学细节（如CID碎裂模式）可为同类肽类分析提供参考。