本次向您介绍的研究论文发表于Sensors & Actuators: B. Chemical期刊第358卷（2022年），题为《Detection of Aβ oligomers in early Alzheimer’s disease diagnose by in vivo NIR-II fluorescence imaging》。该研究由湖北大学化学化工学院有机功能分子合成与应用重点实验室的李恒德、王娇阳、李一帆、陈先、张雯祥，以及武汉工程大学化工与制药学院湖北省新型反应器与绿色化学工艺重点实验室的赵怡兰、刘根燕（通讯作者）和潘杰（通讯作者）共同完成。
这项研究属于生物医学工程与化学传感交叉领域，具体聚焦于阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease， AD）的早期诊断技术开发。阿尔茨海默病是一种神经退行性疾病，其早期阶段症状隐匿，难以察觉，给早期干预和治疗带来巨大挑战。研究表明，β-淀粉样蛋白（Aβ）的异常聚集是AD的关键病理标志。其中，Aβ寡聚体（Aβ oligomers）相较于最终形成的淀粉样斑块（主要含Aβ fibrils），具有更强的神经毒性，并且出现时间更早，被认为是AD早期阶段更理想的生物标志物。因此，开发能够特异性、高灵敏度检测Aβ寡聚体的探针，对于AD的早期诊断具有重大意义。然而，传统用于检测Aβ的荧光探针大多工作在可见光或近红外一区（NIR-I， 700-900 nm），存在组织穿透深度不足、自发荧光干扰强、信噪比低等局限性，不利于活体深度成像。近年来，第二近红外窗口（NIR-II， 1000-1700 nm）荧光成像技术因其更深的组织穿透深度、更低的自发荧光和更高的空间分辨率而备受关注，但此前尚未有专门针对AD诊断、特别是靶向Aβ寡聚体的NIR-II荧光探针报道。基于此，本研究旨在设计并合成一种新型的“给体-受体-给体”（D-A-D）型NIR-II荧光分子探针，旨在实现对Aβ寡聚体的高选择性、高亲和力检测，并验证其在活体AD模型小鼠早期诊断中的应用潜力。
研究详细的工作流程可分为以下几个核心部分：探针设计与合成、理化与光物理性质表征、体外选择性结合与亲和力测试、细胞毒性评估、离体脑切片染色验证以及活体小鼠模型成像研究。
首先，在探针设计与合成方面，研究团队设计并合成了一种名为ETH-BF的新型荧光探针。其分子结构以N，N-二乙基苯胺作为强电子给体（D）和识别基团，以二氟化硼桥联的氮杂富烯作为强电子受体（A），构成了典型的D-A-D推拉电子结构。这种结构设计不仅有助于将荧光发射波长红移至NIR-II区域（目标发射峰位于1015 nm），而且使其荧光对微环境粘度敏感。当探针与刚性的Aβ聚集体结合时，分子内运动受限，会触发由分子内电荷转移效应介导的荧光“开启”响应，从而实现对Aβ的高灵敏度检测。合成路线通过多步有机反应完成，包括亲核取代、铃木偶联、脱保护、连接反应以及与BF3·OEt2的络合，最终得到目标产物ETH-BF。
其次，在性质表征阶段，研究人员对ETH-BF进行了全面的光物理性质分析。结果表明，ETH-BF在二甲基亚砜（DMSO）溶液中最大吸收峰位于850 nm，摩尔消光系数高达2.186 × 10^6 M^−1 cm^−1。在808 nm激光激发下，其最大发射峰位于1015 nm，荧光量子产率为0.39%（以IR-26为参比）。探针表现出明显的溶剂化变色效应，且在不同pH值（2-13）和PBS缓冲液中展现出了良好的化学稳定性。这些性质为其生物应用奠定了基础。
第三，在体外选择性结合与亲和力测试中，这是验证探针核心功能的关键步骤。研究首先通过分子对接模拟，将ETH-BF与Aβ三聚体（PDB: 4NTR）进行对接。结果显示，ETH-BF通过其羰基氧原子、与硼原子相连的氟原子以及醚键氧原子与Aβ寡聚体中的Phe20残基形成了四个氢键，同时其苯环与两个Phe20残基存在π-π堆积相互作用，计算结合能为-32.81 kJ/mol，预示了强结合潜力。随后，通过荧光滴定实验定量评估了探针对Aβ不同形态的选择性。当向ETH-BF溶液中逐步加入Aβ 1-42寡聚体（0-9 μM）时，其NIR-II荧光强度增强了约10倍，并在约30分钟后达到平台期。而对Aβ 1-42纤维体，荧光仅增强约2倍。通过滴定曲线拟合，计算出ETH-BF与Aβ寡聚体的解离常数（Kd）为6.16 ± 2.18 nM，与纤维体的Kd为58.68 ± 36.2 nM，表明其对寡聚体的亲和力比纤维体高近一个数量级。此外，探针对一系列生物小分子（如氨基酸、金属离子）和蛋白质（如血清白蛋白、血红蛋白）均无响应，显示出优异的选择性。
第四，在细胞毒性评估中，采用MTT法检测了ETH-BF对人永生化角质形成细胞（HaCaT）、人宫颈癌细胞（HeLa）和小鼠脑微血管内皮细胞（bEnd.3）的毒性。实验结果显示，在浓度高达30 μM时，细胞存活率仍保持在70%以上，表明ETH-BF在实验浓度范围内生物相容性良好。
第五，进行离体验证。研究人员使用11月龄的APP/PS1转基因AD模型小鼠和同龄野生型（WT）小鼠的脑切片，用ETH-BF进行荧光染色。结果显示，在AD模型小鼠脑切片的海马区（AD病理累积的关键脑区）观察到了清晰的红色NIR-II荧光斑点，而这些斑点与经典的Aβ斑块染料硫黄素S（ThS）的绿色荧光信号高度共定位。在野生型小鼠的脑切片中则未检测到任何ETH-BF信号。这一结果直接证明了ETH-BF能够特异性标记脑组织中的Aβ斑块。
第六，也是最具应用价值的部分，即活体成像研究。研究选用APP/PS1转基因小鼠作为AD模型，并设置了3月龄（疾病早期）和11月龄（疾病晚期）两组，以同龄野生型小鼠作为对照。通过尾静脉注射ETH-BF后，使用NIR-II荧光成像系统对小鼠头部进行实时监测。成像结果显示，注射后5分钟，所有小鼠脑部均出现强烈荧光信号，证明ETH-BF能够快速穿透血脑屏障。注射后4小时，信号达到峰值。关键发现在于：无论是3月龄还是11月龄组，转基因AD小鼠脑部的荧光强度均显著高于同龄野生型小鼠。更有意义的是，3月龄AD小鼠的脑部荧光信号强度甚至高于11月龄AD小鼠。这一现象与Aβ寡聚体在疾病早期（年轻小鼠）占主导，而后期逐渐转化为纤维化斑块的病理过程相符，强烈暗示ETH-BF在活体内对早期、可溶性Aβ寡聚体具有更高的响应性。为了进一步佐证，研究人员还将ETH-BF与不同组别小鼠的脑组织匀浆液共孵育进行体外检测，结果同样显示3月龄AD小鼠脑组织匀浆液引起的荧光增强最为显著，且荧光强度与脑组织匀浆浓度呈良好的线性关系，为活体成像结果的解释提供了体外数据支持。
基于以上系统性的实验结果，本研究得出了明确结论：研究团队成功设计并合成了一种新型的D-A-D型NIR-II荧光探针ETH-BF。该探针发射波长可达1200 nm，具有低细胞毒性、高选择性（对Aβ寡聚体的亲和力Kd = 6.16 nM）和高响应性（结合后荧光增强10倍）。分子对接和结合实验证实了其与Aβ寡聚体的特异性相互作用机制。离体脑切片染色和活体小鼠成像实验共同证明，ETH-BF能够快速穿越血脑屏障，并特异性靶向AD脑内的Aβ病理沉积（尤其是早期的寡聚体），在3月龄的早期AD模型小鼠中实现了高对比度的NIR-II荧光成像。
本研究的科学价值与应用意义重大。科学价值方面：1）首次报道了专门用于靶向Aβ寡聚体的“D-A-D”型NIR-II荧光探针，填补了该领域的技术空白；2）通过合理的分子设计，将识别基团与强给电子基团合二为一，并利用D-A-D结构和ICT效应实现了对Aβ聚集微环境的高灵敏度“开关型”响应，为后续探针设计提供了新思路；3）综合运用分子对接、体外滴定、离体染色和活体成像等多层次验证方法，严谨地证明了探针的性能和作用机制。应用价值方面：1）为阿尔茨海默病的无创、在体、早期诊断提供了一种极具潜力的新型光学成像工具；2）探针优异的血脑屏障穿透能力和对早期病理标志物（Aβ寡聚体）的高选择性，使其有望应用于AD的药物研发（如药效评估）、疾病进程监测以及早期干预效果评价。
本研究的亮点突出体现在以下几个方面：1）目标新颖性：聚焦于AD早期诊断和更具毒性的Aβ寡聚体，并首次将NIR-II成像技术应用于此目标，具有前瞻性。2）探针设计巧妙：将识别功能与光物理性质调控通过D-A-D结构一体化实现，结构紧凑，分子量小利于脑渗透。3）数据链完整且具说服力：从分子水平的对接和结合常数，到细胞水平的毒性，再到组织水平的切片染色，最终到整体动物水平的活体成像，构成了从体外到体内、从分子到整体的完整证据链条。特别是活体实验中观察到年轻AD小鼠比年老AD小鼠信号更强这一关键现象，直接有力地支撑了探针用于“早期”诊断的核心主张。4）结果具有明确的转化医学潜力：探针良好的生物相容性、快速的脑部富集以及清晰的成像对比度，为其未来的临床前和临床研究奠定了基础。这项研究为阿尔茨海默病的早期检测带来了新的希望，是分子影像学与神经科学交叉融合的一项优秀范例。