关于Wnt16作为系统性红斑狼疮生物标志物及其调控细胞增殖与凋亡作用的研究报告
本研究由中国四川大学华西医院检验科的王可芬、蒋怡恒、翟建召、张品、吴宇翔、陈海迪、郑华平、何洋、邓成、吴永康等研究人员共同完成，相关成果发表于学术期刊《Clinical and Experimental Rheumatology》2024年第42卷（第2206-2214页）。
一、 研究背景与目的
本研究属于风湿免疫病学，特别是系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Erythematosus, SLE）的发病机制与生物标志物探索领域。SLE是一种累及多器官系统的自身免疫性疾病，临床表现多样且常反复发作，严重影响患者生活质量和长期预后。目前SLE的诊断主要依赖临床评估和实验室指标，如抗核抗体（ANA）、抗双链DNA抗体（anti-dsDNA）及补体C3、C4等，但这些指标缺乏足够的特异性，例如ANA在健康人群中可能出现假阳性，而anti-dsDNA在部分SLE患者中可能为假阴性。因此，寻找新的、更有效的生物标志物对于SLE的早期诊断、疾病活动度监测和预后评估至关重要。
研究团队的先前工作通过全基因组测序，在中国汉族SLE家系中鉴定出与SLE强相关的WNT16基因罕见错义突变，并证实该突变会损害经典Wnt通路的激活。Wnt16是Wnt家族分泌型糖蛋白成员，可通过激活经典（Wnt/β-catenin）和非经典信号通路，在组织稳态、免疫系统发育等方面发挥调控作用。然而，Wnt16在SLE发病中的具体作用和机制尚不清楚。基于此背景，本研究旨在深入探究Wnt16在SLE患者中的表达情况及其临床意义，评估其作为SLE生物标志物的潜力，并通过体外细胞实验初步探索Wnt16在调控细胞功能（增殖与凋亡）中的作用，从而为理解SLE的发病机制和开发新的诊疗策略提供依据。
二、 详细研究流程
本研究包含相互关联的多个步骤，整合了临床样本分析、生物信息学评估和基础分子细胞生物学实验。
流程一：临床样本收集与分组 研究人员从四川大学华西医院招募了以下参与者：162名SLE患者、96名年龄和性别匹配的健康对照（Healthy Controls, HC），以及154名疾病对照（包括94名类风湿关节炎患者和60名干燥综合征患者）。SLE患者的诊断依据1997年美国风湿病学会分类标准。所有患者均接受过免疫抑制治疗（如糖皮质激素和羟氯喹）。根据SLE疾病活动指数评分，将SLE患者进一步分为活动期疾病组和高疾病活动度组。此外，从SLE患者和HC中分别随机选取了35份和25份外周血抗凝血样本，用于分离外周血单个核细胞。所有血清样本于-80°C保存待测。本研究获得了伦理委员会批准。
流程二：Wnt16表达水平的临床评估 此流程旨在从mRNA和蛋白两个层面，定量评估SLE患者与对照组之间Wnt16的表达差异。 1. mRNA水平检测：使用定量聚合酶链反应技术，检测了35名SLE患者和25名HC的外周血单个核细胞中WNT16基因的mRNA表达水平。 2. 蛋白水平检测：采用酶联免疫吸附测定法，大规模量化了162名SLE患者、96名HC以及154名疾病对照（RA和SS）血清中的Wnt16蛋白浓度。
流程三：Wnt16诊断效能与临床关联性分析 此流程旨在评估Wnt16作为生物标志物的诊断价值，并探索其与SLE临床特征的相关性。 1. 诊断效能分析：使用受试者工作特征曲线分析，评估血清Wnt16蛋白水平在区分SLE患者与HC、以及区分SLE与RA、SS等其他自身免疫病患者的诊断能力，计算曲线下面积、敏感性、特异性等指标。 2. 临床关联性分析：通过统计学方法（如斯皮尔曼相关性分析），探究SLE患者血清Wnt16水平与一系列临床实验室指标（如淋巴细胞百分比、中性粒细胞百分比、碱性磷酸酶、低密度脂蛋白等）以及临床症状（如胸膜炎、皮疹、关节炎、狼疮肾炎等）和自身抗体阳性状态之间的关联。
流程四：Wnt16功能的体外细胞实验探究 此流程旨在通过基因敲低技术，在细胞模型中验证Wnt16的功能。 1. 细胞培养与基因敲低：选择人B淋巴细胞系（Jeko-1细胞）作为模型。通过构建靶向WNT16的短发夹RNA慢病毒载体，感染Jeko-1细胞，建立稳定敲低Wnt16表达的细胞系，并设置阴性对照细胞系。 2. 敲低效率验证：使用qPCR和蛋白质印迹法，分别在mRNA和蛋白水平验证Wnt16在Jeko-1细胞中的敲低效率。 3. 细胞功能表型检测： * 细胞增殖检测：使用CCK-8试剂盒，在感染后24至72小时，检测shRNA-Wnt16组与对照组细胞的增殖活力。 * 细胞凋亡检测：使用流式细胞术，通过FITC-Annexin V和PI双染色法，检测并比较两组细胞的凋亡比例。
流程五：数据统计分析 所有数据使用GraphPad Prism等软件进行分析。组间比较采用非参数曼-惠特尼秩和检验或单因素方差分析。相关性分析采用斯皮尔曼相关。诊断效能通过ROC曲线评估。细胞实验数据以均值±标准差表示，组间差异采用t检验。P值小于0.05被认为具有统计学意义。
三、 主要研究结果
结果一：Wnt16在SLE患者中表达下调 在mRNA水平，SLE患者外周血单个核细胞中的WNT16 mRNA表达量显著低于健康对照组。在蛋白水平，SLE患者血清中的Wnt16蛋白浓度也显著低于HC、RA患者和SS患者。进一步分析显示，无论是高疾病活动度还是低疾病活动度的SLE患者，其血清Wnt16水平均低于HC，且高活动度患者的Wnt16水平又显著低于低活动度患者。这些结果一致表明，Wnt16在SLE患者中表达下调，且其表达水平与疾病活动度呈负相关。
结果二：血清Wnt16具有区分SLE的诊断潜力 ROC曲线分析显示，血清Wnt16蛋白水平在区分SLE与HC时表现出良好的诊断效能。在区分SLE与HC时，曲线下面积为0.809；在区分SLE与RA时，AUC为0.760；在区分SLE与SS时，AUC为0.710。特别是在区分高活动度SLE与HC时，诊断效能最高。这表明血清Wnt16有潜力作为辅助诊断SLE、并将其与其他自身免疫病区分的生物标志物。
结果三：血清Wnt16水平与SLE特定临床指标相关 相关性分析揭示了Wnt16与部分临床指标间的微弱但具有统计学意义的关联：血清Wnt16水平与碱性磷酸酶和淋巴细胞百分比呈弱正相关；而与低密度脂蛋白、中性粒细胞百分比呈弱负相关。临床特征关联分析发现，伴有胸膜炎的SLE患者，其血清Wnt16水平显著低于不伴胸膜炎的患者。Wnt16水平与其他临床症状（如神经系统病变、关节炎、狼疮肾炎、皮疹、心包炎）或常见自身抗体（如ANA、抗dsDNA等）的阳性状态之间未发现显著关联。
结果四：敲低Wnt16抑制细胞增殖并促进凋亡 在Jeko-1细胞中成功敲低Wnt16表达后，细胞功能实验显示：与对照组相比，Wnt16敲低组的细胞增殖能力显著下降；同时，细胞凋亡的比例显著增加。这一结果在细胞水平直接证明了Wnt16具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的功能。结合SLE患者体内Wnt16表达降低的发现，提示Wnt16的表达不足可能通过影响免疫细胞的存活与增殖，参与SLE的发病过程。
四、 研究结论与价值
本研究的结论是：血清Wnt16水平能有效区分SLE患者与健康个体及其他自身免疫性疾病患者，是一个具有高敏感性的潜在生物标志物。SLE患者中Wnt16的表达降低可能通过调控细胞增殖和凋亡，在SLE的发病机制中扮演重要角色。
本研究的科学价值在于：首次在较大规模的临床队列中系统验证了Wnt16在SLE患者外周血中的表达下调，并将其与疾病活动度及特定临床表现（胸膜炎）联系起来，为理解SLE的病理生理提供了新的分子视角。应用价值在于：明确了血清Wnt16作为辅助诊断SLE生物标志物的潜力，特别是在鉴别诊断方面，为未来开发新的实验室检测指标奠定了基础。此外，细胞实验揭示了Wnt16在调控淋巴细胞命运中的基本功能，为探索靶向Wnt通路治疗SLE的可能性提供了初步实验依据。
五、 研究亮点
六、 其他有价值的内容
研究团队在讨论部分提出了若干有价值的观点和未来研究方向：首先，他们推测Wnt16表达下调可能与糖皮质激素等治疗反应有关，因为所有入组患者均接受过治疗。其次，他们指出Wnt16与低密度脂蛋白的负相关可能提示其与SLE患者常见的血脂异常及炎症过程存在联系。此外，与碱性磷酸酶的正相关可能反映了Wnt16在骨代谢中的已知作用。最后，作者坦诚指出了本研究的局限性，例如所有病例均为治疗后患者，未来需要在初治患者队列中验证Wnt16的诊断效能；未对SLE进行更细致的亚型分析；以及未来可以探索将Wnt16与其他实验室标志物联合使用以提升诊断性能。这些讨论为后续研究指明了方向。