关于STING通路激活通过神经炎症在骨癌痛大鼠模型中诱导外周敏化的研究报告
一、 研究团队与发表情况
本研究由张雨欣、王伟等人领衔的研究团队共同完成。参与单位主要包括上海交通大学医学院附属胸科医院麻醉科以及上海大学医学院。该研究以题为《Activation of the STING pathway induces peripheral sensitization via neuroinflammation in a rat model of bone cancer pain》的原始研究论文形式，发表于inflammation research期刊的2023年第72卷。论文于2022年7月7日收稿，经过修订后于2022年10月25日被接受，并于2022年11月8日在线发表。
二、 学术背景与研究目的
本研究属于疼痛神经生物学与癌症疼痛治疗领域，聚焦于慢性疼痛中一种极为严重且复杂的类型——骨癌痛（Bone Cancer Pain, BCP）。骨癌痛通常涉及炎症性和神经病理性疼痛机制的复杂交互作用。其中，外周敏化（即在骨转移部位持续的传入刺激、炎症反应以及背根神经节初级感觉神经元可塑性的改变）在BCP的发生发展中起着核心作用。
研究背景：既往研究表明，神经炎症在BCP的发生发展中扮演重要角色。干扰素基因刺激蛋白（Stimulator of Interferon Genes, STING）是一种感知胞质DNA的先天性免疫传感器，在炎症和癌症转移中具有重要作用。新近研究提示，STING是痛觉感受的关键调节因子。在神经损伤或肿瘤微环境中，神经元或胶质细胞可能面临线粒体应激，导致线粒体DNA泄漏至细胞质中。这些泄漏的DNA可被环状GMP-AMP合成酶（cGAS）感知，并激活下游的STING通路，进而通过激活干扰素调节因子3（IRF3）和核因子κB（NF-κB）等转录因子，诱导I型干扰素和促炎因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α）的表达，引发神经炎症。然而，在BCP的背景下，STING通路是否在背根神经节（Dorsal Root Ganglia, DRG）神经元中被激活，及其是否通过驱动神经炎症参与外周敏化和疼痛调控，此前尚不清楚。
研究目的：基于以上背景，本研究旨在探究STING通路在骨癌痛中的作用。具体目标包括：1) 验证在BCP大鼠模型中，DRG神经元内STING通路是否被激活；2) 探究这种激活是否与线粒体应激和神经炎症相关；3) 评估使用特异性STING抑制剂C-176进行药理学干预，能否缓解疼痛行为并抑制相关炎症通路，从而评估STING作为BCP治疗新靶点的潜力。
三、 研究详细流程
本研究遵循严谨的动物实验设计，主要流程可概括为：骨癌痛模型建立与验证 → 疼痛行为学评估 → 组织与分子水平检测（包括线粒体形态、STING通路蛋白及炎症因子表达）→ 药理学干预与效果评估。
1. 动物与BCP模型建立： * 研究对象：成年雌性Sprague-Dawley大鼠（6-8周龄）。 * 建模方法：大鼠麻醉后，使用Walker 256大鼠乳腺癌细胞系建立经典胫骨内注射BCP模型。实验组（BCP组）将含有5×10^5个活肿瘤细胞的悬液10μL注射入右胫骨髓腔。对照组（假手术组）注射等体积经热处理的灭活肿瘤细胞。建模后定期观察。
2. 疼痛行为学评估： * 评估指标与时间：于建模前（基线）及建模后第4、7、11、14、17、21天进行评估。 * 机械痛阈（Paw Withdrawal Mechanical Threshold, PWMT）：使用von Frey纤毛垂直刺激大鼠右后肢足底，以引发缩足反应的力值（克）作为PWMT，评估机械性痛觉超敏。 * 肢体使用评分（Limb Use Score, LUS）：观察大鼠自由活动时的步态，根据肢体使用情况进行0-4分评分，评估运动诱发痛。 * 样本量：行为学测试每组n=15。
3. 模型验证与组织学分析： * 骨组织学与显微CT（Micro-CT）：在特定时间点处死大鼠，取胫骨进行以下分析： * H&E染色：观察肿瘤浸润和骨皮质破坏情况。 * Micro-CT扫描与三维重建：量化分析骨体积/总体积（BV/TV）和骨小梁连接密度（Conn.D），客观评估骨质破坏程度。 * 样本量：组织学与Micro-CT分析每组n=4。
4. 分子与细胞生物学检测： * 检测部位：主要聚焦于腰段（L3-L5）背根神经节。 * 检测时间点：多个关键时间点（如第7、14、21天）或专注于疼痛高峰期的第14天。 * 主要实验方法与样本量： * 透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）：观察DRG神经元内线粒体的超微结构（如肿胀、嵴结构消失），评估线粒体应激。样本量未明确说明。 * 蛋白质印迹（Western Blotting）： * 检测目标：线粒体应激标志物Bax；STING蛋白及其下游通路蛋白：磷酸化TBK1（p-TBK1）、总TBK1、磷酸化IKK（p-IKK）、总IKK、磷酸化NF-κB p65（p-p65）、总p65；下游促炎因子：IL-1β、IL-6、TNF-α。 * 内参：GAPDH。磷酸化蛋白水平以其与相应总蛋白的比值表示。 * 样本量：通常为每组n=6-8。 * 实时定量PCR（RT-qPCR）：检测DRG中STING的mRNA表达水平，以GAPDH为内参基因。样本量n=5。 * 酶联免疫吸附试验（ELISA）：定量检测DRG组织匀浆中IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白浓度。样本量n=6。 * 免疫荧光染色（Immunofluorescence Staining, IF）： * 目的：在细胞水平定位并半定量分析蛋白表达。使用共聚焦显微镜观察。 * 染色组合：STING/Tuj1（神经元标志物）；p-TBK1/Tuj1；p-IKK/Tuj1；p-p65/Tuj1。DAPI复染细胞核。 * 分析指标：计算目标蛋白的平均荧光强度（Mean Fluorescence Intensity），以及Tuj1阳性神经元中目标蛋白阳性细胞的百分比。 * 样本量：通常每组n=4。
5. 药理学干预实验： * 药物：STING特异性抑制剂C-176。 * 给药方案： * 单次给药：在建模后第10天（疼痛已显著建立），分别进行腹腔注射（525 nM和5250 nM两个剂量）或鞘内注射（70 nM）。给药后1、2、4、24、48、72、96小时检测PWMT，评估快速和持续镇痛效果。每组n=5。 * 重复给药：从第10天至第16天，每天腹腔注射5250 nM C-176，并于每次给药后24小时评估PWMT，观察长期疗效及是否产生耐受。对照组给予等体积玉米油溶剂。每组n=5。 * 机制验证：在给药干预后，取DRG组织，采用上述Western Blotting和免疫荧光方法，检测STING、下游信号通路蛋白（p-TBK1, p-IKK, p-p65）及促炎因子（IL-1β, IL-6, TNF-α）的表达变化，以验证C-176的作用靶点。
6. 数据分析流程： * 所有行为学测试和大部分实验均在盲法下进行。 * 行为学数据（PWMT, LUS）使用双因素重复测量方差分析（Two-way repeated-measures ANOVA），继以Tukey事后检验。 * 其他组间比较：两组间使用双尾非配对t检验；多组间比较使用单因素方差分析（One-way ANOVA），继以Tukey事后检验。 * 以P值小于0.05为具有统计学显著性。 * 使用ImageJ和GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析和图表绘制。
四、 主要研究结果
1. BCP模型成功建立，大鼠出现显著疼痛行为和骨质破坏。 * 疼痛行为：假手术组大鼠在术后早期因针道损伤出现一过性疼痛，随后逐渐恢复。而BCP组大鼠从第7天左右开始，PWMT持续显著降低，LUS评分下降，表明出现持续且严重的机械性痛觉超敏和运动诱发痛，持续至观察终点（第21天）。 * 骨质变化：H&E染色显示BCP大鼠胫骨骨髓腔被肿瘤细胞填充，骨皮质遭到明显破坏。Micro-CT定量分析证实，BCP组的BV/TV和Conn.D均显著低于假手术组。这些结果共同验证了BCP模型的成功。
2. BCP大鼠DRG神经元出现线粒体应激且STING表达上调。 * 线粒体形态：TEM结果显示，BCP组DRG神经元内的线粒体出现明显的结构缺陷，包括肿胀和嵴结构消失。 * 线粒体应激标志物：Western Blotting显示，BCP组DRG中促凋亡蛋白Bax的表达水平显著高于假手术组，提示线粒体应激通路被激活。 * STING表达时空变化： * 蛋白水平：Western Blotting显示，从第7天到第21天，BCP组DRG中STING蛋白表达均显著高于同期假手术组，并在第14天达到峰值。 * mRNA水平：RT-qPCR在第14天检测到BCP组STING mRNA表达上调。 * 细胞定位与数量：免疫荧光双标显示，STING蛋白与神经元标志物Tuj1共定位。BCP组DRG中STING的平均荧光强度以及Tuj1阳性神经元中STING阳性细胞的比例均显著增加。 * 结果逻辑联系：这些结果首次系统证实，在BCP发展过程中，DRG神经元同时发生了线粒体损伤和STING通路的上调，提示线粒体应激释放的mtDNA可能是激活STING的潜在触发因素，为后续探究其下游炎症效应奠定了基础。
3. STING下游炎症通路在BCP模型中被激活。 * 信号通路激活：Western Blotting显示，BCP组DRG中p-TBK1/TBK1、p-IKK/IKK和p-p65/p65的比值均显著升高，表明STING/TBK1/IKK/NF-κB信号轴被激活。 * 蛋白的细胞定位：免疫荧光证实，p-TBK1、p-IKK和p-p65主要表达于Tuj1阳性的DRG神经元内，且在BCP组中这些磷酸化蛋白的表达强度和阳性神经元比例均显著增加。 * 促炎因子释放： * Western Blotting和ELISA结果一致显示，BCP组DRG中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白水平显著高于假手术组。 * 结果逻辑联系：该部分结果清晰地描绘出一条从STING激活到下游炎症因子产生的完整信号链条，并将神经炎症的起源定位到了DRG初级感觉神经元本身，而非传统认为的仅限于胶质细胞。这为“STING激活驱动神经炎症导致外周敏化”的假设提供了直接的分子证据。
4. STING抑制剂C-176有效缓解BCP并抑制神经炎症通路。 * 镇痛效果： * 单次给药：腹腔注射C-176在1小时内即产生剂量依赖性的快速镇痛效应，高剂量（5250 nM）的镇痛作用可持续至少72小时。鞘内注射（70 nM）同样有效，但作用持续时间较短（约24小时）。 * 重复给药：连续7天腹腔注射高剂量C-176，能产生持续且稳定的镇痛效果，未观察到明显的药物耐受现象。 * 分子机制验证： * 抑制STING表达：令人注意的是，C-176处理不仅阻断了STING的激活，还显著降低了BCP大鼠DRG中STING蛋白本身的表达水平（通过Western Blotting和免疫荧光验证）。 * 抑制下游信号通路：C-176处理后，BCP大鼠DRG中升高的p-TBK1、p-IKK和p-p65水平均被显著逆转。 * 减少促炎因子产生：C-176处理也显著降低了DRG中IL-1β、IL-6和TNF-α的上调。 * 结果对结论的贡献：药理学干预实验提供了最直接的因果证据。C-176通过抑制STING，不仅减轻了疼痛行为，还逆转了STING下游的整个炎症信号级联反应。这强有力地证明了STING通路的激活是BCP中外周敏化和神经炎症的关键驱动因素，并且靶向STING具有治疗潜力。
五、 研究结论与价值
结论：本研究提供了确凿的证据，表明在骨癌痛大鼠模型中，背根神经节神经元中的STING通路被激活。这种激活可能与线粒体应激和线粒体DNA泄漏有关。激活的STING通过驱动TBK1/IKK/NF-κB信号轴，上调IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子的表达，引发局部神经炎症，最终导致外周痛觉敏化和骨癌痛的发生与发展。使用特异性抑制剂C-176阻断STING，可有效缓解疼痛并抑制上述炎症过程。
科学价值： 1. 机制创新：首次系统阐明了STING通路在DRG神经元中介导骨癌痛外周敏化的作用，将先天性免疫感应、线粒体应激、神经元自身炎症和慢性疼痛联系起来，为理解BCP的复杂机制提供了全新视角。 2. 靶点发现：明确提出了STING可作为治疗骨癌痛的一个潜在新药靶点，为开发新型镇痛药物提供了理论依据和实验基础。 3. 概念拓展：强调了神经元自身不仅是疼痛信号的传递者，也是主动参与免疫炎症调节的单元，丰富了神经免疫互作在疼痛领域的内涵。
应用价值：STING抑制剂（如C-176）在临床前模型中显示出良好的镇痛效果，且通过系统给药（腹腔注射）比中枢给药（鞘内注射）效果更持久，这为未来开发针对BCP的系统性治疗策略带来了希望。尽管仍需大量临床转化研究，但本研究为应对目前临床治疗棘手的骨癌痛指明了新的研究方向。
六、 研究亮点
七、 其他有价值内容
研究团队在讨论部分也客观指出了本研究的局限性，并提出了未来研究方向： * 局限性： * 虽然观察到了线粒体损伤和Bax表达上调，但未直接定量检测胞质中mtDNA的水平，这是未来需要补充的关键实验。 * 研究证实了STING通路整体的作用，但未使用TBK1或IKK的特异性抑制剂来验证通路中各个中间环节的必要性。 * 对于BCP导致DRG神经元线粒体损伤的上游原因（如肿瘤微环境中的活性氧、氮物质等）尚未深入探究。 * 未来方向：提示肿瘤细胞可能通过释放某些物质，被传入神经末梢摄取并传递至DRG神经元，引发氧化应激和线粒体损伤，这将是后续研究的重要切入点。
这项研究是一项设计周密、数据翔实、逻辑清晰的优秀工作，显著增进了对骨癌痛机制的理解，并为开发新的治疗策略奠定了重要的理论基础。