本研究由佛罗里达国际大学Herbert Wertheim医学院细胞与分子医学系的Lee Seng Lau、Maria Suarez、Brandon Fernandez、Joseph Souchak以及通讯作者Charles J. Dimitroff等人，联合帝国理工学院、宾夕法尼亚大学等多个研究机构共同完成。研究成果于2026年2月18日在线发表于国际学术期刊*Frontiers in Immunology*，论文标题为“Glycoengineering CAR-T cells to overcome galectin-3-mediated immunosuppression”。
嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor (CAR)-T cell）疗法已革新了复发或难治性B细胞恶性肿瘤的治疗格局，然而，CAR-T细胞在体内的有限持久性（in vivo persistence）以及治疗限制性毒性持续制约着疗效的持久性。弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma， DLBCL）是最常见的侵袭性B细胞淋巴瘤，尽管R-CHOP等化学免疫治疗方案取得了进展，但仍有相当比例的患者会出现复发或难治性疾病。目前，抗CD19 CAR-T细胞疗法已被确立为符合条件的DLBCL患者的二线标准治疗，其依据是ZUMA-7和TRANSFORM等随机临床试验的结果。然而，即便实现了深度缓解，CAR-T细胞的疗效仍常常受到体内持久性不足以及肿瘤微环境（tumor microenvironment， TME）中免疫抑制信号的影响。
在肿瘤微环境介导免疫逃逸的诸多因子中，半乳糖凝集素（galectins）家族已成为关键的免疫调节因子。该家族包含15种β-半乳糖苷结合凝集素，其中galectin-1、-3和-9能够通过激活共抑制通路、干扰共刺激信号、改变细胞因子产生以及促进凋亡或耗竭来抑制T细胞免疫。尤为重要的是，galectin介导的调控不仅取决于凝集素的丰度，还取决于免疫细胞表面展示的聚糖（glycan）结构。已有研究表明，由α2,6-唾液酸转移酶1（ST6Gal1）介导的α2,6唾液酸化修饰（α2,6 sialylation）是galectin-3结合的已知抑制因子。这提示，在CAR-T细胞制备过程中糖基转移酶表达的变化可能会影响其对galectin-3免疫抑制的易感性。
基于以上背景，研究团队提出了以下科学问题：CAR-T细胞是否具备特定的聚糖特征，从而决定了它们在面对免疫抑制性galectins时的脆弱性？能否通过糖工程化（glycoengineering）手段改造CAR-T细胞，以增强其对galectin-3的抵抗能力？本研究旨在系统探究DLBCL微环境中galectin-3的水平、CAR-T细胞的聚糖图谱及其对galectin-3介导免疫调节的敏感性，并评估通过强制表达ST6Gal1进行糖工程化改造是否能增强CAR-T细胞在galectin-3富集的免疫抑制性肿瘤微环境中的持久性和抗肿瘤效能。
本研究可分为六个核心实验流程，各步骤环环相扣，逐步深入。首先，研究团队开展了DLBCL患者galectin水平的临床评估。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测了31例DLBCL患者及31例年龄匹配的健康对照者血清中galectin-1、-3和-9的水平。同时，利用公共基因表达数据库（GEO）中GSE2350和GSE173263等微阵列和RNA测序数据集，分析了DLBCL组织中galectin的转录水平。此外，研究还运用ImmucellAI和GSCA整合数据库，对肿瘤浸润免疫细胞中galectin-3的表达来源进行了生物信息学分析。
第二，研究对CAR-T细胞的galectin结合特性及糖基转移酶表达谱进行了全面评估。从正常健康供体白细胞分离外周血单个核细胞（PBMCs），通过免疫磁珠分选获得幼稚T细胞，经CD3/CD28激活后，以感染复数（MOI）为3的慢病毒载体进行转导，并在IL-2支持下扩增10天制备抗CD19 CAR-T细胞。采用重组人galectin-1、-3和-9与流式细胞术检测CAR-T细胞表面的galectin配体结合能力，以50mM乳糖作为竞争性结合对照。同时，通过实时定量PCR（RT-qPCR）系统检测了关键糖基转移酶基因的表达变化，包括ST6Gal1、B4GALT1、MGAT5、GCNT1、GCNT2和ST3Gal1等，以18S为内参基因，每种检测至少进行3次独立实验。
第三，研究深入解析了CAR-T细胞的N-糖组学（N-glycomics）特征。采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术，对CAR-T细胞、非转导扩增T细胞及幼稚T细胞的N-聚糖进行全谱分析。细胞样本经裂解、透析、还原、烷基化、胰酶消化后，以PNGase F释放N-聚糖，经全甲基化处理后进行质谱分析。同时，利用植物凝集素染色（SNA检测α2,6唾液酸、MAL II检测α2,3唾液酸、STL检测多聚N-乙酰乳糖胺）对细胞表面糖链结构进行验证。
第四，研究构建了ST6Gal1过表达CAR-T细胞并进行功能性验证。利用ST6Gal1-P2A-抗CD19 CAR双顺反子慢病毒载体转导T细胞，获得ST6OE CAR-T细胞。通过流式细胞术验证α2,6唾液酸化水平升高后，系统比较了ST6OE CAR-T细胞与常规CAR-T细胞在galectin-1/-3结合能力、galectin-3诱导的细胞凋亡（Annexin V/PI双染法检测）以及基线增殖能力（CCK-8法）方面的差异。
第五，研究开展了一系列体外功能实验以评估糖工程化改造对CAR-T细胞抗肿瘤功能的影响。采用荧光素酶标记的CD19阳性淋巴瘤细胞系（Raji-luc+为galectin-3低表达，SUDHL-6-luc+为galectin-3高表达）与CAR-T细胞以20:1的效应-靶比共培养16小时，在有无外源性重组galectin-3的条件下，通过生物发光成像检测肿瘤杀伤活性。同时，利用细胞因子蛋白组阵列分析了galectin-3刺激下CAR-T细胞分泌的多种促炎和抗炎细胞因子的变化，并通过细胞内流式染色验证了IL-5的表达变化。
第六，研究在体内异种移植模型中评估了ST6OE CAR-T细胞的抗肿瘤效能。将6-8周龄的NOD-scid IL2rg缺陷（NSG）小鼠通过尾静脉接种1×10⁵个Raji-luc+细胞，7天后分别回输培养基、对照T细胞、常规CAR-T细胞或ST6OE CAR-T细胞（各5×10⁶个细胞）。每周通过活体生物发光成像监测肿瘤负荷，持续35天，并用Kaplan-Meier法评估小鼠生存期。实验终点采集脾脏，通过流式细胞术检测CAR阳性T细胞的体内持久性。
临床与生物信息学分析结果：ELISA检测显示，DLBCL患者血清中galectin-3和galectin-9水平显著高于健康对照者（galectin-3: 9.07±0.50 ng/ml vs 7.17±0.50 ng/ml，p<0.01；galectin-9: 7.18±0.53 ng/ml vs 5.47±0.53 ng/ml，p<0.01），而galectin-1水平在两组间无显著差异。通过年龄校正的多元线性回归分析，年龄被确认为galectin-3水平的独立预测因子。GSE2350数据集分析显示，DLBCL肿瘤组织中galectin-1和galectin-3的转录水平显著高于正常B细胞亚群。ImmucellAI分析进一步揭示，galectin-3表达与巨噬细胞浸润丰度呈正相关，与B细胞浸润呈负相关，提示除肿瘤细胞自身表达外，巨噬细胞富集的肿瘤微环境是galectin-3的重要来源。
CAR-T细胞糖基化特征：流式分析显示，与幼稚T细胞相比，抗CD19 CAR-T细胞（无论CD4⁺还是CD8⁺亚群）对galectin-1和galectin-3的结合能力显著增强，但对galectin-9的结合无显著差异。RT-qPCR分析揭示其分子基础：CAR-T细胞中促进N-聚糖分支和天线延长的酶基因（B4GALT1、MGAT5、GCNT2）表达显著上调，而具有galectin配体抑制功能的关键酶ST6Gal1表达显著下降。MALDI-TOF MS质谱分析证实，CAR-T细胞的三天线N-聚糖峰（携带多聚N-乙酰乳糖胺链，即galectin-1/-3的高亲和力配体）显著高于幼稚T细胞。植物凝集素染色结果与质谱数据一致：CAR-T细胞的STL结合力（识别多聚N-乙酰乳糖胺）增强，而SNA结合力（识别α2,6唾液酸）显著降低。
ST6Gal1过表达的保护效果：ST6OE CAR-T细胞经SNA染色验证α2,6唾液酸化水平升高后，galectin-1和galectin-3的结合显著减少。galectin-3剂量反应实验显示，重组galectin-3可诱导CAR-T细胞发生浓度依赖性凋亡。在4μg/ml galectin-3处理后，CAR-T细胞的Annexin V⁺/PI⁺凋亡率显著高于非转导扩增T细胞，而ST6OE CAR-T细胞对galectin-3诱导的凋亡具有显著抗性。增殖实验显示，ST6OE CAR-T细胞的72小时基线增殖能力显著优于常规CAR-T细胞。
抗肿瘤功能的体外评估：在无galectin-3条件下，ST6OE CAR-T细胞与常规CAR-T细胞对Raji-luc+肿瘤的杀伤效能相当，表明强制表达ST6Gal1未损害CAR-T细胞的内在细胞毒功能。然而，在galectin-3存在或面对内源性galectin-3高表达的SUDHL-6-luc+肿瘤细胞时，ST6OE CAR-T细胞展现出显著更优的杀瘤活性。细胞因子蛋白组分析发现，galectin-3暴露可诱导CAR-T细胞大量分泌IL-5，而这一效应在ST6OE CAR-T细胞中被显著抑制。进一步实验表明，外源性IL-5可直接削弱CAR-T细胞的细胞毒功能，但ST6Gal1过表达并不能保护CAR-T细胞免受IL-5介导的抑制，说明ST6Gal1是通过阻断上游galectin-3信号传导而非下游IL-5效应来发挥保护作用的。
体内抗肿瘤效能：异种移植模型实验结果令人振奋。活体生物发光成像显示，接受ST6OE CAR-T细胞治疗的小鼠肿瘤负荷显著低于常规CAR-T细胞治疗组（p<0.01）。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，ST6OE CAR-T细胞治疗组小鼠的总生存期显著延长（p=0.011）。流式细胞术分析实验终点脾脏样本证实，ST6OE CAR-T细胞在体内的持久性显著增强，脾脏中检测到的CAR阳性T细胞频率明显高于对照组（p<0.05）。
本项研究系统阐明了一个核心发现：通过糖工程化改造强制表达ST6Gal1，增加CAR-T细胞表面α2,6唾液酸化修饰水平，能够有效阻断galectin-3配体活性，保护CAR-T细胞免受galectin-3诱导的凋亡和细胞因子偏移，从而显著改善CAR-T细胞在体内的持久性和抗肿瘤效能。研究揭示，CAR-T细胞在制备过程中因T细胞活化和代谢重编程导致ST6Gal1表达下调，同时上调了galectin配体合成酶（MGAT5/B4GALT1/GCNT2），形成一种galectin-3高度敏感的聚糖特征，这为CAR-T细胞的体内功能缺陷提供了新的解释维度。
本研究的科学价值在于首次将galectin-3确立为CAR-T细胞功能的关键外源性抑制因子，并建立了靶向细胞表面α2,6唾液酸化修饰作为一种增强CAR-T细胞抵抗galectin富集的免疫抑制性肿瘤微环境的策略。在应用价值层面，该研究为优化细胞免疫治疗提供了一条新颖的糖工程化路径。鉴于galectin-3在多种实体瘤和血液肿瘤微环境中均有高表达，且α2,6唾液酸化修饰还可能调控与其他聚糖结合受体（如siglecs）的相互作用，因此该策略可能具有超越单一肿瘤类型的广泛适用性。研究同时指出，小分子抑制剂靶向特定galectins以改善CAR-T细胞持久性也是一个值得探索的方向。
本研究具有以下显著亮点：第一，研究视角新颖，将糖生物学与肿瘤免疫治疗有机结合，从CAR-T细胞自身糖基化脆弱性的独特角度解释了体内功能局限性。第二，实验设计严谨，从临床样本分析到生物信息学挖掘，再到体外分子机制验证和体内功能验证，形成了完整的证据链闭环。第三，技术手段全面，综合运用了MALDI-TOF MS糖组学分析、多色流式细胞术、细胞因子蛋白组阵列等多种前沿技术平台。第四，研究发现galectin-3诱导的IL-5分泌直接影响CAR-T细胞功能，这一galectin-3-IL-5轴的发现拓展了对galectin免疫调控机制的理解，并提示了CAR-T细胞治疗中监测相关细胞因子的临床意义。