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作者与机构
本研究由Yevgeniya R. Lapik、Croydon J. Fernandes、Lester F. Lau和Dimitri G. Pestov*（通讯作者）共同完成，研究团队来自美国伊利诺伊大学芝加哥分校（University of Illinois at Chicago）生物化学与分子遗传学系。研究成果发表于2004年7月2日的《Molecular Cell》期刊（Vol. 15, 17–29），标题为《Physical and Functional Interaction Between Pes1 and Bop1 in Mammalian Ribosome Biogenesis》。

学术背景
研究领域聚焦于核糖体生物合成（ribosome biogenesis）的分子机制，尤其是哺乳动物细胞中60S核糖体亚基的成熟过程。核糖体是细胞蛋白质合成的核心机器，其组装异常与癌症等疾病密切相关。此前研究发现，小鼠核仁蛋白Bop1及其酵母同源蛋白Erb1p对5.8S/28S rRNA的成熟至关重要，并能通过p53依赖的途径引起细胞周期阻滞。然而，哺乳动物核糖体合成通路的分子细节尚不明确，尤其是Pes1（小鼠中与斑马鱼Pescadillo和酵母Nop7p同源的蛋白）的功能机制尚未阐明。本研究旨在揭示Pes1与Bop1的相互作用及其在核糖体合成和细胞增殖调控中的协同作用。

研究流程与方法
1. Pes1与Bop1的相互作用验证
- 酵母双杂交筛选：以Bop1为诱饵蛋白，从小鼠cDNA文库中筛选出Pes1的N端截短体，进一步验证全长Pes1与Bop1的直接结合。
- 体外结合实验：通过GST pull-down实验证实重组表达的GST-Pes1与昆虫细胞表达的His-Bop1直接结合。
- 细胞共定位分析：免疫荧光显示Pes1与Bop1共定位于核仁，且两者的相互作用影响Pes1的核仁定位。

1. 转座子介导的Pes1突变体构建

   • 突变策略：采用Tn5转座子随机插入Pes1基因，通过NotI酶切移除转座子序列，保留48 bp插入片段，构建一系列Pes1突变体（如Pes1-tn8、Pes1-tn14等）。
     
   • 功能筛选：通过BrdU-light实验筛选出6个可逆性抑制细胞周期的突变体（如Pes1-tn8、Pes1-tn9），并分析其对rRNA加工的影响。
     

2. rRNA加工缺陷的表型分析

   • 代谢标记实验：用[³H]尿苷和L-[甲基-³H]甲硫氨酸标记RNA，通过凝胶电泳和Northern杂交检测28S/5.8S rRNA成熟障碍。
     
   • 脉冲追踪实验：发现Pes1突变体导致32S pre-rRNA积累，表明其对ITS2区域加工的抑制作用。
     

3. Pes1-Bop1功能关联的机制解析

   • 免疫共沉淀：证实Pes1与Bop1在pre-60S核糖体复合物中形成物理复合物。
     
   • 蔗糖梯度离心：显示Pes1突变体（如Pes1-tn2）因失去Bop1结合能力而无法稳定整合至pre-60S颗粒。
     

主要结果
1. Pes1与Bop1的直接相互作用：酵母双杂交和体外实验均证实两者结合，且该相互作用依赖于Pes1 N端（如tn2突变体完全破坏结合）。
2. Pes1突变体的功能表型：
- 细胞周期阻滞：强效突变体（如Pes1-tn8）通过p53依赖途径诱导G1期阻滞。
- rRNA加工缺陷：突变体导致32S pre-rRNA积累和28S/5.8S rRNA生成减少，提示Pes1参与ITS1、ITS2和3’ETS区域的切割。
3. Bop1依赖的功能机制：
- 核仁定位：Pes1的核仁富集需Bop1介导（tn2突变体丧失核仁定位）。
- pre-60S组装：Pes1-Bop1复合物是60S亚基成熟的关键节点，两者协同调控多步pre-rRNA加工。

结论与意义
1. 科学价值：首次阐明Pes1与Bop1在哺乳动物核糖体合成中的协同作用，揭示了pre-60S组装的质量监控机制。
2. 应用价值：为癌症治疗提供新靶点，例如通过干扰Pes1-Bop1复合物可激活p53依赖的细胞周期检查点。
3. 理论创新：提出“核仁应激（nucleolar stress）”通过p53通路调控细胞增殖的分子模型。

研究亮点
1. 方法创新：开发了高效的转座子介导的哺乳动物基因突变体筛选系统，为功能基因组学研究提供新工具。
2. 发现重要性：
- 鉴定出Pes1的Bop1结合域（N端198-204位氨基酸），为后续结构研究奠定基础。
- 揭示核糖体合成缺陷与细胞周期调控的直接关联，拓展了对“核仁监视（nucleolar surveillance）”机制的理解。

其他价值
研究还暗示Pes1可能参与DNA复制（类似酵母Nop7p），为后续探索其多功能性提供了线索。