基于氟碳改性壳聚糖的非侵入性经皮递送平台用于黑色素瘤免疫治疗与病毒疫苗
一、 研究作者与发表信息
本研究由来自中国苏州大学功能纳米与软物质研究所（FUNSOM）、苏州纳米科技协同创新中心、江苏省碳基功能材料与器件重点实验室以及苏州英诺邦医药科技有限公司的研究团队完成。主要作者包括 Wenjun Zhu, Ting Wei, Yuchun Xu, Qiutong Jin, Yu Chao, Jiaqi Lu, Jun Xu, Jiafei Zhu, Xiaoying Yan, Muchao Chen, Qian Chen 和 Zhuang Liu。该研究成果于2024年发表在学术期刊 Nature Communications 上（文章链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-45158-6）。
二、 研究背景与目标
本研究属于生物材料、药物递送与免疫治疗交叉领域。经皮给药（Transdermal Drug Delivery）因其无创、无痛、可避免肝脏首过效应、患者依从性好等优势，被视为口服和皮下注射给药的有吸引力的替代方案。然而，皮肤最外层的角质层构成了强大的物理屏障，使得传统方法难以高效递送亲水性生物大分子（如抗体、蛋白质抗原、核酸等），这限制了经皮给药在生物治疗领域的广泛应用。当前，虽然存在化学增强剂（如促渗肽）和物理增强设备（如微针、电穿孔、超声导入）等策略，但它们分别存在效率低下、操作复杂、可能造成皮肤损伤或增加感染风险等问题。因此，开发一种安全、高效、非侵入性的生物大分子经皮递送平台是领域内的重要挑战。
在此背景下，本研究旨在开发一种基于氟碳改性壳聚糖的新型平台，以实现抗体和抗原等生物大分子高效、非侵入性的经皮递送，并将其应用于黑色素瘤的局部免疫治疗和SARS-CoV-2病毒疫苗的经皮免疫，探索其作为通用生物大分子经皮递送载体的潜力。
三、 详细研究流程
本研究包含多个相互关联的实验流程，从材料设计与表征、体外/离体渗透机制研究，到体内治疗与疫苗接种评估，最终扩展至大型动物模型验证。
1. 材料设计与表征 * 研究过程：首先，研究团队合成了氟碳改性壳聚糖。具体方法是将全氟烷基羧酸通过酰胺键偶联到阳离子多糖壳聚糖上，得到氟碳取代度约为4.9%的FCS。随后，将FCS与免疫球蛋白G（IgG）、卵清蛋白（OVA）或SARS-CoV-2病毒刺突蛋白S1亚基等生物大分子按不同质量比（如1：1）混合，通过自组装形成纳米复合物。 * 研究方法与样本：利用动态光散射和透射电子显微镜表征纳米复合物的粒径（约200 nm）和形态。通过圆二色光谱和竞争性酶联免疫吸附测定证明，FCS包载过程基本不影响蛋白质的二级结构和抗体活性。纳米复合物的Zeta电位显示，随着FCS比例增加，复合物带正电性增强。
2. 体外/离体经皮渗透能力与机制研究 * 研究过程与样本：使用标准Franz扩散池系统，以新鲜的小鼠皮肤为模型，评估FCS/蛋白质纳米复合物的透皮效率。使用FITC荧光标记的IgG或OVA作为示踪物，测量不同时间点受体室中的荧光强度以及皮肤组织中的滞留量，计算累积渗透率和总递送量。 * 关键发现：当FCS与蛋白质质量比为1:1时，渗透效率最高。FCS/IgG和FCS/OVA的总递送量分别达到约36 μg/cm²和55 μg/cm²，分别是游离蛋白质组的6倍和11倍。共聚焦显微镜成像证实，纳米复合物形式（而非游离形式）的蛋白质能成功递送至真皮层。 * 渗透机制探究： * 细胞间途径（Intercellular route）：使用人永生化角质形成细胞（HaCaT）单层模型，监测跨上皮电阻（TEER）。结果显示，加入FCS/IgG后TEER显著下降，移除后恢复，表明FCS能可逆地打开细胞间紧密连接。透射电镜观察到皮肤经FCS/IgG处理后，紧密连接打开、细胞间隙增大。免疫荧光和蛋白质印迹分析进一步表明，FCS促进了肌球蛋白轻链（MLC）的磷酸化，导致细胞骨架重排和紧密连接蛋白ZO-1的分布紊乱，从而增大细胞间隙。 * 皮肤附属器途径（Transappendageal route）：通过免疫荧光共定位发现，FCS/IgG与毛囊和汗腺存在共定位，表明该途径也参与了FCS介导的经皮递送。 * 跨细胞途径（Transcellular route）：通过顶膜胞吐实验和利用网格蛋白抑制剂的Franz扩散实验，证明该途径贡献可忽略不计。结论：FCS纳米复合物主要通过细胞间途径和皮肤附属器途径实现高效经皮渗透。
3. 体内黑色素瘤免疫治疗研究 * 研究过程与样本：建立C57BL/6雌性小鼠B16F10黑色素瘤模型。将FCS/抗体（如抗PD-L1抗体，aPDL1）纳米复合物与空白软膏（Aquaphor®）混合，制成乳膏状制剂，局部涂抹于肿瘤表面，并用透明薄膜覆盖12小时。 * 体内递送验证：使用放射性碘-125标记的IgG（¹²⁵I-IgG）进行药代动力学研究。结果显示，与游离抗体相比，FCS/¹²⁵I-IgG在肿瘤中的积累显著更高（峰值超过120% ID/g），而在其他主要器官中水平较低。ELISA检测和肿瘤切片荧光成像也证实了抗体在肿瘤内的高效、持续递送。 * 单一免疫检查点阻断治疗：将荷瘤小鼠分为未处理组、静脉注射aPDL1组、壳聚糖/aPDL1经皮给药组和FCS/aPDL1经皮给药组。FCS/aPDL1组展现出最强的肿瘤生长抑制效果和最长生存期。流式细胞术分析显示，FCS/aPDL1治疗组肿瘤中CD4+和CD8+ T细胞浸润显著增加，且CD8+ T细胞中颗粒酶B、Ki67和IFN-γ的表达上调，表明细胞毒性T淋巴细胞（CTL）被有效激活。 * 联合免疫检查点阻断治疗：在双侧肿瘤模型（模拟原发和远端转移灶）中，研究FCS共递送aPDL1和抗CTLA-4抗体（aCTLA4）的效果。值得注意的是，静脉注射联合抗体组因严重的副作用（推测为细胞因子风暴）导致半数小鼠死亡，而经皮给药各组均未观察到明显异常。FCS/aPDL1/aCTLA4经皮联合给药不仅有效抑制了原发肿瘤的生长，还诱导了显著的远端效应，抑制了对侧远端肿瘤的生长。流式分析表明，在远端肿瘤中，CD8+ T细胞（尤其是Ki67+ CD8+ T细胞）比例上升，调节性T细胞（Tregs）比例下降，验证了系统性的抗肿瘤免疫应答被成功激活。
4. 体内经皮疫苗接种研究 * 研究过程与样本：构建FCS/S1/poly(I:C)纳米疫苗，其中S1是SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合域抗原，poly(I:C)是Toll样受体3激动剂作为佐剂。优化了纳米复合物的配比（FCS:S1:poly(I:C) = 2:1:1）。 * 免疫效果评估：将小鼠分为未处理组、FCS/S1/poly(I:C)经皮接种组和S1/poly(I:C)皮下注射组。经皮接种采用与治疗类似的软膏涂抹方式。 * 结果：经皮接种诱导的S1特异性抗体滴度与皮下注射组相当，表明体液免疫应答有效。更重要的是，在脾脏中，经皮接种组CD4+和CD8+ T细胞分泌IFN-γ的水平显著高于皮下注射组，显示了更强的细胞免疫应答。在长期记忆免疫评估中，经皮接种组在加强免疫后，脾脏中的效应记忆CD4+和CD8+ T细胞比例也显著更高。机制探讨发现，虽然经皮接种后淋巴结中抗原阳性树突状细胞（DC）的比例低于皮下注射，但皮肤局部的DC对抗原的摄取更高，提示经皮疫苗可能更有效地在局部激活DC，然后迁移至淋巴结引发后续免疫。
5. 大型动物模型验证 * 研究过程与样本：使用兔和猪的皮肤进行离体Franz扩散实验，评估FCS/IgG的渗透能力。同时，在新西兰兔模型上进行体内经皮疫苗接种实验（使用OVA/poly(I:C)模型疫苗）。 * 结果：FCS/IgG在兔和猪皮肤上均展现出显著的渗透增强效果，总递送量分别达到约32 μg/cm²和60 μg/cm²。在兔体内，经皮接种OVA疫苗诱导的抗体滴度与肌内注射组相近，尤其在后期时间点。这初步证明了FCS平台适用于更厚、更接近人类皮肤的大型动物皮肤。
四、 主要研究结果及其逻辑关联
本研究的结果环环相扣，逻辑链条清晰： 1. 材料基础：成功合成FCS，并证明其能与多种蛋白质形成稳定的、不影响蛋白活性的纳米复合物（结果一），这为后续所有应用奠定了基础。 2. 能力验证与机制阐明：通过离体和体外实验证实FCS纳米复合物具有高效的经皮递送能力（结果二），并深入揭示了其通过可逆打开细胞间紧密连接和利用皮肤附属器两条主要途径的渗透机制（结果三）。这解释了“为什么FCS能高效递送”，为体内应用提供了理论依据。 3. 治疗应用验证：在黑色素瘤模型中，体内分布实验（结果四）首先直观证明了FCS能将抗体高效、选择性地递送至局部肿瘤。随后的治疗实验（结果五）证实，这种局部高浓度递送能有效激活肿瘤微环境内的T细胞免疫，抑制肿瘤生长。联合治疗实验（结果六）进一步证明，该平台可安全地共递送多种抗体，并激发系统性免疫应答产生远端效应，其效果优于且毒性低于全身给药。这部分结果回答了“FCS递送能否有效用于疾病治疗”。 4. 预防应用扩展：将平台应用于SARS-CoV-2模型疫苗（结果七），发现经皮接种不仅能引发与常规注射相当的体液免疫，还能诱导更强的细胞免疫和免疫记忆。这展示了该平台在疫苗接种领域的潜力，回答了“FCS递送能否用于预防性疫苗”。 5. 转化前景探索：在兔和猪模型上的成功验证（结果八），初步证明了该技术向临床应用转化的可能性，回答了“该技术是否适用于更接近人类的皮肤模型”。
五、 研究结论与价值
本研究得出结论：氟碳改性壳聚糖（FCS）可作为一种高效、通用、非侵入性的生物大分子经皮递送平台。该平台无需额外的物理或化学刺激，仅通过简单的局部涂抹软膏制剂，即可实现抗体、抗原等生物大分子的高效皮肤渗透。
其价值体现在： * 科学价值：首次系统地将氟碳改性壳聚糖应用于经皮递送领域，并深入阐明了其通过细胞间和附属器途径的渗透机制，为设计新型经皮递送材料提供了新思路。 * 应用价值： 1. 肿瘤免疫治疗：为黑色素瘤等皮肤相关肿瘤提供了一种局部、高效、低毒的免疫检查点抑制剂给药新策略，有望减少全身给药的严重副作用。 2. 疫苗接种：为开发可自我给药的非侵入性疫苗（尤其是针对呼吸道病毒如SARS-CoV-2的疫苗）提供了有前景的技术平台，有助于在医疗资源紧张地区快速、大规模接种。 3. 平台潜力：该平台具有普适性，未来或可扩展用于经皮递送其他肽类、蛋白质或核酸类药物，服务于更广泛的生物治疗领域。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
研究团队在方法学上注重多角度验证。例如，在验证体内递送时，同时采用了放射性标记示踪、ELISA定量和荧光成像三种方法，相互印证，使数据更加可靠。此外，在疫苗研究中，不仅检测了常规的抗体滴度，还深入分析了细胞免疫应答、记忆T细胞形成以及局部DC活化等关键免疫学指标，评估更为全面。这些严谨的实验设计增强了整个研究的说服力。