该篇文档由Jianan Liu、Limin Pan、Chunfeng Shang等多位作者共同完成，主要作者来自中国科学院上海硅酸盐研究所高性能陶瓷和超微结构国家重点实验室、中国科学院神经科学研究所、韩国首尔国立大学化学系等多个机构。该研究于2020年4月17日发表于学术期刊 Science Advances，标题为”A highly sensitive and selective nanosensor for near-infrared potassium imaging”。
本研究属于跨学科的应用科学与工程领域，具体涉及纳米技术、分析化学、生物成像和神经科学。钾离子（K⁺）是细胞内最丰富的阳离子，在神经传递、心跳、肌肉收缩和肾功能等多种生物过程中至关重要。细胞内或细胞外K⁺浓度的变化往往预示着生理功能异常或多种疾病（如心脏功能障碍、癌症、糖尿病等）。因此，开发能够监测K⁺浓度时空动态变化的有效策略，特别是直接光学成像方法，具有巨大的科学和应用价值。然而，现有的K⁺光学探针存在显著不足：首先，其灵敏度不足以检测生理条件下通常发生的毫摩尔级（mM）的K⁺浓度波动；其次，大多数探针难以区分由Na⁺/K⁺泵进行跨膜转运时K⁺与伴随钠离子（Na⁺）的微小浓度变化；最后，大多数现有传感器只能被短波长光（如紫外或可见光）激发，导致在活体组织中穿透深度有限，无法应用于深层组织成像。相比之下，近红外（near-infrared, NIR）成像在深层组织成像方面具有独特优势。因此，本研究旨在开发一种高灵敏度、高选择性，且可由近红外光激发的K⁺纳米传感器，用于活细胞和活体动物的K⁺成像。
本研究包含一个系统性的工作流程，从纳米传感器的设计、合成、表征，到其光学性能测试，再到在细胞和活体动物模型中的生物应用。具体流程如下：
1. K⁺纳米传感器设计与合成： 纳米传感器的设计核心是构建一个多层复合纳米结构。首先，合成核壳结构的上转换纳米粒子（upconversion nanoparticles, UCNPs），其核心为NaYF₄:Yb/Tm，外壳为NaYF₄:Yb/Nd。该UCNP能将近红外（808 nm）光转换为紫外（~350 nm）光。其次，通过微乳液法在该UCNP外包裹一层致密二氧化硅，再包裹一层介孔二氧化硅纳米粒子（mesoporous silica nanoparticles, MSNs），形成“UCNP@致密SiO₂@介孔SiO₂”的三明治结构。然后，选择性蚀刻掉中间的致密二氧化硅层，形成具有中空腔体的“UCNP@hollow MSNs（UCNP@hMSiO₂）”结构。接着，将一种商业化的K⁺指示剂——钾离子结合苯并呋喃间苯二甲酸酯（potassium-binding benzofuran isophthalate, PBFI）负载到该中空腔体中。PBFI可与K⁺结合并在被紫外光激发时发出荧光（~540 nm），但其对K⁺的选择性相对于Na⁺较低。为了解决选择性问题并提高灵敏度，研究的关键步骤是在纳米粒子外表面涂覆一层K⁺选择性过滤膜。该膜包含直径约5.7 Å的微孔，结构与链霉菌钾离子通道（KcsA）类似，孔道内壁的羰基氧使其能够选择性地允许K⁺自由通过，同时阻挡其他生物相关阳离子（如Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺等）的扩散。涂覆过滤膜后，最终形成了“屏蔽型纳米传感器”（shielded nanosensor）。作为对照，未涂覆过滤膜的被称为“非屏蔽型纳米传感器”（unshielded nanosensor）。此外，为了增强生物相容性和胶体稳定性，研究人员还在屏蔽型纳米传感器表面接枝了聚乙二醇（PEG）。
2. 纳米传感器的结构表征： 研究人员利用透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、动态光散射（DLS） 和能量色散X射线光谱（EDS） 等技术，对纳米传感器构建过程中的每一步进行了详细的形貌和结构表征。TEM图像显示，从UCNP@致密SiO₂到UCNP@中空SiO₂，再到最终涂覆过滤膜的纳米传感器，其形态都得到了良好控制。屏蔽型纳米传感器的直径约为85 ± 2.3 nm，而非屏蔽型为81 ± 1.8 nm，这表明过滤膜厚度约为2 nm。DLS数据也证实了过滤膜的存在。最重要的是，EDS线扫描分析显示，当屏蔽型纳米传感器分散在含有多种阳离子（Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺）的混合溶液中时，只有K⁺的信号出现在介孔和空心腔体区域，而其他阳离子的信号被有效阻挡在外，这直接证明了过滤膜卓越的K⁺选择性和屏蔽效应。
3. 光学传感性能测试（水溶液）： 研究人员首先通过光谱分析验证了UCNP在350 nm的发射峰与PBFI在365 nm的最大吸收峰高度重叠，确保了高效的发光共振能量转移（luminescence resonance energy transfer, LRET）。在808 nm近红外光激发下，屏蔽型纳米传感器显示出PBFI在540 nm的特征发射峰，而UCNP在350 nm的发射完全消失，表明LRET效率高达100%。当向溶液中逐步增加K⁺浓度（0-150 mM，生理范围）时，屏蔽型纳米传感器在540 nm处的荧光强度相应增强（变化超过12倍），而来自UCNP的450 nm和475 nm发射峰保持不变，可作为内参比信号。通过计算540 nm与475 nm处的荧光强度比值（I₅₄₀ₙₘ/I₄₇₅ₙₘ），研究人员发现该比值与K⁺浓度呈线性关系，且与探针浓度无关，证明该纳米传感器能够定量测量K⁺浓度。检测限（3σ/斜率）低至2.8 × 10⁻⁶ M，足以检测大多数生物组织中亚毫摩尔级的K⁺变化。在选择性测试中，屏蔽型纳米传感器的荧光对K⁺浓度变化高度敏感，但对Na⁺浓度的增加几乎无响应，其对K⁺相对于Na⁺的选择性比高达~16.1，远优于非屏蔽型纳米传感器（~2.6）。动力学测试表明，屏蔽型纳米传感器对K⁺浓度变化的响应非常快（秒内达到最大响应的90%），且具有良好的可逆性和稳定性（在超过20个K⁺富集-缺失循环中信号保持稳定）。这种增强的性能归因于过滤膜的双重作用：一是选择性筛选，仅允许K⁺进入；二是通过膜上的K⁺亲和位点吸附溶液中的K⁺，并基于唐南平衡原理（Donnan equilibrium），由于MSN内腔带负电，使得纳米传感器内部的局部K⁺浓度远高于外部溶液，从而放大了可检测的信号。
4. 细胞水平应用： 为了在更复杂的生物环境中验证纳米传感器的功能，研究团队在人类胚胎肾细胞（HEK 293）上进行了测试。首先，他们通过监测细胞死亡（使用2-脱氧葡萄糖和洋地黄皂苷处理）和增殖（在不同浓度血清中培养）过程中培养液里的细胞外K⁺浓度变化，证明了PEG修饰的屏蔽型纳米传感器能够线性地报告细胞的活性和生长状态，而非屏蔽型纳米传感器或游离的PBFI染料则无法观察到明显信号变化。 其次，为了进一步提高监测灵敏度，研究团队将纳米传感器锚定在细胞膜表面。他们通过生物素-链霉亲和素系统，将链霉亲和素修饰的屏蔽型纳米传感器特异性结合到生物素化的HEK 293细胞膜上。然后，使用K⁺外排刺激剂混合物（尼日利亚菌素、布美他尼和哇巴因）处理细胞，抑制Na⁺/K⁺泵和Na⁺/K⁺/2Cl⁻协同转运体，并诱导K⁺外流。共聚焦显微镜成像显示，膜锚定的屏蔽型纳米传感器荧光信号在刺激后显著增强，约在20-30分钟达到峰值，而非屏蔽型纳米传感器的信号响应要弱得多。通过结合电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES） 测量的细胞内K⁺含量变化，研究人员计算了K⁺外流速率。结果显示，计算出的K⁺外流速率的时间曲线与屏蔽型纳米传感器荧光变化的时间曲线高度吻合，且屏蔽型传感器的信号变化幅度远大于非屏蔽型。此外，当逐渐移除刺激剂时，荧光信号也相应下降，进一步证明了传感的准确性。这些结果共同表明，该屏蔽型纳米传感器能以更高的灵敏度、选择性和准确性实时监测活细胞中诱导的K⁺外流动力学。
5. 活体动物脑内成像应用： 研究最引人注目的部分是在完整活体动物大脑中的应用。研究人员将PEG修饰的屏蔽型纳米传感器注射到小鼠大脑皮层。在一个颅骨开窗处，他们通过远距离（约3 mm）施加KCl来诱发皮层扩散性抑制（cortical spreading depression, CSD） 事件。CSD是神经活动中一种波状的K⁺释放和传播现象。研究人员同时记录了局部场电位（local field potential） 和通过颅窗采集的纳米传感器光学信号。结果发现，纳米传感器荧光信号的增加与电生理记录的CSD事件完全同步。荧光成像清晰地显示，在刺激后，一股增加的细胞外K⁺浓度波逐渐传播过整个皮质表面。通过分析波传播方向上不同位置荧光信号的时间延迟，计算出该传播波的速度为2.9 ± 0.8 mm/min，这与在偏头痛先兆患者中使用功能磁共振成像测得的波速（3.5 ± 1.1 mm/min）无显著差异。作为对照，注入非屏蔽型纳米传感器的小鼠大脑中未检测到明显的波状信号，这凸显了外过滤膜对于体内高灵敏度成像的关键作用。
6. 斑马鱼脑内多模态同时成像： 为了进一步拓展应用并探究K⁺在神经活动（如癫痫）中的作用，研究人员在斑马鱼幼鱼上进行了创新性的多模态同时成像。他们将钾纳米传感器加载到斑马鱼的前脑和中脑，同时该斑马鱼全神经元表达一种基因编码的钙离子指示剂jRGECO1a。然后，使用戊四唑（pentylenetetrazole, PTZ）诱导癫痫样神经元激活。通过双光子激发钙指示剂和近红外激发钾纳米传感器，他们同时监测了神经元钙活动和细胞外钾浓度的变化。结果显示，PTZ处理后，在特定的脑区（如前视顶盖和松果体）出现了强烈的癫痫样神经元钙活动，而钾信号则在更大范围的脑区（包括活动区域附近的区域）出现显著升高。这表明，癫痫样神经元活动会导致细胞外K⁺浓度增加，并且释放的K⁺可以扩散到邻近的脑区，这为理解癫痫的启动和传播机制提供了直接的证据。
本研究的主要结论是，通过将上转换纳米粒子和钾离子指示剂封装在介孔二氧化硅纳米粒子的中空核内，并涂覆一层K⁺选择性过滤膜，成功构建了一种超高灵敏度和选择性的K⁺纳米传感器。该传感器的创新之处在于：1）利用近红外光激发，实现了深层组织成像；2）通过过滤膜的物理筛选和局部K⁺富集效应，同时解决了传统探针选择性和灵敏度不足的核心难题；3）该传感器能够快速、定量地检测活细胞和完整动物大脑中K⁺浓度的微小动态波动。研究不仅在细胞水平验证了其监测细胞活性、增殖及离子通道/泵功能的能力，更成功应用于小鼠脑内CSD波的实时成像和斑马鱼脑内神经元活动与K⁺动态的同时监测，为神经科学研究提供了强有力的新工具。
本研究的科学价值和应用价值巨大。在科学层面，它为解决活体、深层组织、高时空分辨率的离子动态监测这一长期挑战提供了新颖且有效的策略。其“过滤膜+局部浓度放大”的设计理念，可以推广到开发其他离子或小分子的高灵敏度传感器。在应用层面，该纳米传感器有望广泛应用于脑科学研究，帮助科学家更深入地理解神经信号传递、皮层扩散性抑制、癫痫、缺血性脑卒中等与K⁺动态密切相关的生理和病理过程。随着上转换纳米粒子量子效率的进一步提高，以及结合光纤内窥镜和光度测量技术，该平台有望实现对自由活动动物脑内钾离子的实时、长期成像，从而推动对相关脑疾病机制的理解和潜在治疗靶点的发现。