主要作者及发表信息 本研究由华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科的冯旭（Feng Xu）、韩琳琳（Linlin Han）、王亚锋（Yafeng Wang）、邓大令（Daling Deng）、丁媛媛（Yuanyuan Ding）、赵帅（Shuai Zhao）、张庆彤（Qingtong Zhang）、马鲁林（Lulin Ma）及通讯作者陈向东（Xiangdong Chen）共同完成。该研究成果于2023年发表于《BMC Medicine》期刊，题为《Prolonged anesthesia induces neuroinflammation and complement‑mediated microglial synaptic elimination involved in neurocognitive dysfunction and anxiety‑like behaviors》。
研究背景与目的 本研究聚焦于围术期神经认知障碍（PND）这一老年手术患者中频发的并发症，其与延长麻醉引起的神经毒性密切相关。尽管已有研究认识到海马区神经炎症在七氟烷诱导的神经毒性（SIN）中的关键作用，但其背后的神经形态病理学基础尚不明确。过去的研究多聚焦于调控神经炎症的信号通路，而较少系统性地研究与学习记忆直接相关的神经元形态和突触结构。本研究旨在探究延长麻醉下，小胶质细胞介导的突触修剪在SIN发病机制中的作用，以期阐明其神经形态病理学基础，为PND的防治提供新靶点。
研究流程与方法 本研究通过建立七氟烷诱导的神经毒性（SIN）大鼠模型，分为四个核心实验来逐步验证假说。 实验一旨在验证SIN模型的行为学与病理学特征。研究人员将13-18月龄的雄性SD大鼠随机分为对照组和七氟烷（Sevo）组。Sevo组大鼠在100%氧气中暴露于3%七氟烷4小时以诱导SIN，对照组则吸入100%氧气4小时。麻醉后第一天进行旷场实验和高架十字迷宫评估焦虑样行为；同时通过Morris水迷宫评估认知功能，分别在麻醉后第1天和第3天进行探测试验。行为学评估后，收集脑组织，通过酶联免疫吸附测定检测皮层和海马的促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）；通过Western blotting检测NF-κB炎症通路蛋白、凋亡相关蛋白及突触蛋白（PSD95、Syn1、SYP）的表达；通过免疫荧光染色检测神经元兴奋性标志物c-Fos及小胶质细胞形态（Iba1染色）与数目，并采用Sholl分析对小胶质细胞形态进行量化。此外，还通过苏木精-伊红染色、尼氏染色和TUNEL法评估神经元形态、尼氏小体数量及细胞凋亡。为监测神经元电活动，在另一批大鼠的海马植入电极，记录并分析七氟烷暴露前后的局部场电位，并计算爆发抑制比（BSR）。为进一步探索分子机制，对海马组织进行了RNA测序（RNA-seq），筛选差异表达基因（DEGs）并进行KEGG和GO富集分析。 实验二旨在明确小胶质细胞在SIN中的关键作用。通过给大鼠喂食含有CSF1R抑制剂PLX3397的饲料（300 mg/kg）21天来清除脑内小胶质细胞。清除效果通过Iba1表达和细胞计数验证。将PLX3397处理的大鼠进行七氟烷暴露，并设置喂食溶剂饲料的Sevo-AIN76A组。设立Sevo-AIN76A组和Sevo-PLX3397组。通过水迷宫、旷场和高架十字迷宫检测行为学变化。利用分子生物学技术检测炎症因子、NF-κB通路、补体C1qa、吞噬标志物CD68及突触蛋白的表达。同时，再次使用RNA-seq分析小胶质细胞清除后海马基因表达的变化。 实验三旨在探究单纯抑制神经炎症是否能挽救突触丧失。大鼠在七氟烷暴露期间及之后，共接受三次非甾体抗炎药美洛昔康（Meloxicam，2.5 mg/kg）的腹腔注射，并设置生理盐水注射的Sevo-NS组作为对照。Sevo-NS组和Sevo-Meloxicam组在麻醉后检测海马区炎症因子（IL-1β）、补体C1qa和突触蛋白（Syn1、PSD95）的表达，并观察补体标记的突触（C1q与PSD95共标）数量变化。 实验四旨在验证补体级联反应中起始分子C1q在突触消除中的核心作用。在SIN模型建立后1小时，通过脑室内注射10微升的C1q中和抗体，以IgG2b作为对照，设立Sevo-IgG组和Sevo-C1q组。采用情境恐惧条件反射测试和旷场实验评估大鼠的记忆和焦虑行为。通过ELISA和Western blot检测海马内C1q及C1qa水平，同时检测小胶质细胞标志物Iba1和突触蛋白（PSD95、Syn1、SYP）的表达，以评估补体阻断对神经炎症和突触结构的影响。
研究成果一：延长麻醉诱导大鼠认知功能障碍、焦虑样行为及神经炎症，抑制神经元兴奋性但不引发凋亡。 行为学结果显示，七氟烷暴露后第一天，Sevo组大鼠在水迷宫平台象限的停留时间和穿越次数显著减少，旷场实验中心区停留时间和进入次数、高架十字迷宫开臂停留时间和进入次数均显著减少，表明SIN模型诱发了认知障碍和焦虑样行为。机制上，ELISA检测发现Sevo组大鼠皮层和海马区TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著增加。Western blot和免疫荧光显示，海马内磷酸化NF-κB p65表达上调，且其向细胞核内的转移增加，说明NF-κB炎症通路被激活。电生理记录显示，七氟烷暴露导致海马出现爆发-抑制模式，爆发抑制比显著增加。免疫荧光染色提示海马CA1区c-Fos表达下调，这共同证明神经元兴奋性受到抑制。然而，TUNEL染色为阴性，尼氏小体数量及凋亡通路蛋白（Cleaved caspase-3/caspase-3，Bcl-2/Bax）表达均无显著变化，排除了神经元凋亡作为早期病理改变的可能性。这些结果指向突触结构损伤可能是认知功能障碍的主要原因。
研究成果二：延长麻醉激活小胶质细胞、改变其形态并向促炎表型转化。 对海马小胶质细胞的分析表明，Sevo组小胶质细胞数量增加。RT-PCR结果显示，促炎表型标志物mRNA（如IL-1β、TNF-α、CD86）上调，而抗炎表型标志物mRNA（如IL-4、IL-10、Arg1）下调。Sholl分析和三维形态重建揭示了小胶质细胞形态的显著变化：细胞体增大，伪足回缩、变短且分支减少，表现为最大交叉点数降低。这些形态学和表型的变化证实了小胶质细胞被激活并处于促炎功能状态。
研究成果三：转录组测序揭示突触相关基因广泛下调，补体系统被激活。 RNA-seq分析结果出乎意料地显示，差异表达基因（DEGs）在KEGG通路和GO条目中高度富集于不同类型的突触及其组分，如多巴胺能突触、胆碱能突触、谷氨酸能突触及突触后致密区、突触前膜等。表达热图进一步显示，富集在这些通路的基因在Sevo组普遍下调，这暗示了广泛的突触丢失。同时，后续的分子生物学验证了测序发现：Sevo组突触后蛋白PSD95和突触前蛋白Syn1、SYP的mRNA和蛋白水平均显著降低。相反，补体系统的关键成分C1qa及其下游C3的mRNA和蛋白水平显著上调。
研究成果四：补体介导的小胶质细胞吞噬导致海马突触消除和树突棘丧失。 研究人员发现了突触丢失的直接证据。首先，补体C1qa与PSD95的共定位点数量显著增多，表明C1qa沉积于突触上执行“吃掉我”信号的功能。其次，小胶质细胞的吞噬标志物CD68表达增加，Iba1与CD68的共定位点增多，确认其吞噬功能增强。化学趋化受体CX3CR1与Iba1的共标点也增多，表明小胶质细胞迁移和黏附能力增强。最关键的是，免疫荧光和共聚焦显微镜清晰显示，Iba1标记的小胶质细胞内部包裹着PSD95标记的突触蛋白点，其数量在Sevo组显著增加，这是小胶质细胞吞噬突触的直接形态学证据。最终效果上，海马CA1区突触密度和突触数量显著下降。扫描电镜观察突触超微结构也发现，七氟烷暴露后突触囊泡减少、突触后膜连续性中断。此外，RNA-seq显示树突和树突棘相关基因下调，高尔基染色及Sholl分析证实CA1区神经元树突棘总数和树突分支复杂性均显著降低。
研究成果五：清除小胶质细胞、抑制神经炎症或中和C1q均可挽救突触损失并改善行为。 实验二证明，PLX3397清除小胶质细胞后，SIN大鼠的认知功能（水迷宫穿越平台次数和时间增加）和焦虑样行为（旷场和高架十字迷宫实验指标改善）得到显著恢复。分子层面，小胶质细胞清除阻断了补体C1qa与突触前蛋白SYP的共定位，降低了CD68、C1qa和磷酸化NF-κB p65的表达，并恢复了PSD95、Syn1、SYP的蛋白水平。RNA-seq显示，清除小胶质细胞使先前下调的各类突触及突触组分相关基因的表达上调。 实验三证明，美洛昔康抑制神经炎症后，海马IL-1β水平降低，同时补体C1qa表达下降，突触蛋白PSD95和Syn1表达回升，且C1q标记的PSD95突触点减少。这表明仅通过抑制炎症即可中断补体介导的突触消除过程。 实验四证明，脑室内注射C1q中和抗体直接中和C1q后，SIN大鼠的情境恐惧记忆（僵直时间百分比增加）和焦虑样行为（旷场中心区探索增加）得到改善。分子检测显示，C1q中和降低了C1qa水平，同时抑制了小胶质细胞激活标志物Iba1的表达，并恢复了PSD95、Syn1和SYP多种突触蛋白的水平，证实了C1q作为突触消除启动信号的核心地位。
研究结论与价值 本研究首次系统性地阐明了延长麻醉引起神经认知功能障碍的神经形态病理学基础。其核心结论是：延长七氟烷麻醉通过触发海马区NF-κB介导的神经炎症，激活小胶质细胞并使其形态和功能改变，进而启动由补体C1q/C3介导的“吃掉我”信号通路，导致小胶质细胞异常吞噬并消除多种类型的突触，最终造成突触和树突棘的丧失，引起认知功能障碍与焦虑样行为。通过药物清除小胶质细胞、抑制神经炎症或中和补体C1q，均可有效阻断这一病理性突触消除过程。 本研究的科学价值在于，将小胶质细胞介导的突触修剪这一在阿尔茨海默病等神经退行性疾病中已知的机制，首次引入到围术期神经认知障碍的研究中，揭示了SIN的全新发病机制。其临床应用价值在于为PND提供了三个潜在的治疗靶点（小胶质细胞、神经炎症、补体系统），其中抗炎药物美洛昔康和C1q中和策略具有直接的转化医学前景。
研究亮点 1. 机制新颖性：首次将补体介导的小胶质细胞突触吞噬确立为麻醉相关神经毒性的病理核心。 2. 证据链完整：从行为学、组织形态学、分子生物学、电生理学、超微结构到转录组学，提供了多层次、系统性的证据，从现象观察到机制验证形成了严密闭环。 3. 转化潜力强：通过清除小胶质细胞、抑制炎症和中和C1q这三种不同策略，均验证了挽救突触和行为学表型的可能性，为多靶点干预策略提供了坚实依据。