结直肠癌免疫治疗响应差异的时空单细胞解析：局部与系统性免疫动态的协同作用

作者与发表信息
本研究由北京大学BIOPIC（生物医学前沿创新中心）与生命科学学院的Yuqing Chen、Dongfang Wang等领衔，联合北京大学肿瘤医院的多位研究者共同完成，通讯作者为Dongfang Wang、Aiwen Wu和Zemin Zhang。研究成果于2024年7月8日发表于Cancer Cell（Volume 42, Issue 7），标题为《Spatiotemporal single-cell analysis decodes cellular dynamics underlying different responses to immunotherapy in colorectal cancer》。

学术背景
免疫检查点阻断（Immune Checkpoint Blockade, ICB）疗法（如PD-1抑制剂）在微卫星不稳定（MSI）型结直肠癌（CRC）中效果显著，但多数微卫星稳定（MSS）型患者响应有限。此外，MSI患者中也存在疗效差异，提示现有生物标志物（如MSI状态）的预测能力不足。因此，解析ICB治疗下肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）和系统性免疫的时空动态，对优化治疗策略至关重要。本研究旨在通过多时间点、多组织单细胞测序，揭示CRC患者对PD-1阻断的响应差异机制。

研究流程与方法
1. 患者队列与样本采集
- 队列设计：纳入22例接受PD-1阻断治疗的CRC患者（含2例十二指肠癌），其中12例完全缓解（CR）、7例部分缓解（PR）、3例疾病稳定（SD）。
- 时空采样：采集169份匹配样本（肿瘤组织、癌旁正常组织、外周血），覆盖基线及治疗后多个时间点（部分患者达4次采样）。
- 技术平台：采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞TCR测序（scTCR-seq）并行分析，共获得975,275个高质量细胞。

1. 单细胞数据分析

   • 细胞注释：通过无监督聚类和标志基因表达，鉴定6大类细胞（T细胞、B细胞、髓系细胞等）及91个亚群。
     
   • 动态量化：计算基线细胞比例和治疗后动态变化，采用线性回归模型预测治疗响应关联性（如Therapeutic Index, TI）。
     
   • 程序化分析：通过非负矩阵分解（NMF）识别TME中的协同细胞程序（如“TLS样程序”“肿瘤富集程序”），并分析其与临床响应的相关性。
     

2. 肿瘤反应性T细胞追踪

   • 表型定义：基于耗竭标志（如PDCD1、LAYN）和CXCL13表达，定义肿瘤反应性样（Tumor-Reactive-like, TTR-like）CD8+ T细胞。
     
   • 克隆演化：结合TCR序列追踪克隆扩增与表型转换，区分终末耗竭（Terminally Exhausted, Tex）与前体耗竭（Precursor Exhausted, Texp）亚群。
     
   • 外周关联：通过跨组织TCR共享分析，鉴定血液来源的TTR-like细胞（Blood-associated TTR-like），并分析其表型特征。
     

3. 实验验证

   • 多重免疫荧光：在独立队列（n=16）中验证CXCL13+ CD8+ T细胞的时空分布。
     
   • 流式细胞术：检测外周CD8+ T细胞的HLA-DR表达，验证转录组预测的MHC II相关特征。
     

主要结果
1. 响应相关的TME重塑程序
- TLS样程序：在CR患者中显著增强，包含滤泡辅助T细胞（TFH）和生发中心B细胞，与三级淋巴结构（Tertiary Lymphoid Structure, TLS）形成相关（图2e-f）。
- 肿瘤富集程序：在PR患者中持续活跃，包含耗竭T细胞（Tex）、4-1BB+ Treg等免疫抑制性群体，其动态变化与肿瘤退缩负相关（TI < 0）。

1. TTR-like细胞的响应异质性

   • 基线差异：CR患者肿瘤中TTR-like细胞比例更高（p=0.046），且克隆扩增程度与疗效正相关（R²=0.62，图3c-d）。
     
   • 动态分化：CR患者治疗后Texp细胞比例上升而Text细胞减少，PR患者则两者均积累，提示疗效差异源于终末耗竭阻断能力（图4e-g）。
     

2. 外周免疫的关键作用

   • 血液来源TTR-like细胞：具有更低耗竭表型（低LAYN、高GZMK），且在CR患者中富集（图5e）。其浸润伴随MHC II通路激活（如HLA-DRA↑），可能通过增强抗原呈递促进抗肿瘤响应。
     
   • 预测标志物：基线外周CD8+ T细胞的MHC II相关基因（HLA-DRA、CD74）可区分CR与PR（AUC=0.798），并在头颈鳞癌（HNSCC）外部数据集中验证（图6g-h）。
     

结论与意义
1. 科学价值
- 首次系统刻画了CRC患者PD-1阻断下的时空免疫图谱，揭示了局部（TME程序）与系统性（外周T细胞）免疫的协同响应机制。
- 提出“血液来源TTR-like细胞”作为疗效增强的关键媒介，为联合治疗（如促进T细胞浸润）提供新靶点。

1. 临床意义
   
   • 预测标志：MHC II相关特征或可补充MSI状态，优化患者分层。
     
   • 治疗优化：PR患者可能需要延长ICB疗程以阻断耗竭进程，或联合靶向LAMP3+ DC等免疫抑制群体。
     

研究亮点
1. 技术创新：整合多时间点、多组织单细胞数据与TCR追踪，解析克隆演化与表型转换的时空规律。
2. 概念突破：提出“细胞程序”框架（如TLS样程序），超越单细胞簇的静态分析，捕捉TME的动态协同。
3. 跨癌种验证：关键发现在NSCLC和HNSCC数据集中复现，提示机制的普适性。

局限性
样本量（尤其MSS患者）和功能实验的不足需后续扩大队列与机制研究补充。数据已公开于交互式平台（http://crc-icb.cancer-pku.cn/）。