本研究由哥伦比亚大学生物医学工程系及Herbert Irving综合癌症中心的Shuo Liu、Mengrui Liu、Zhenzhen Wang、Shiqi Hu、Kaiyue Zhang、Chao Lu、Xiao Cheng、Ming Shen、Jianing Bi、Dashuai Zhu及Ke Cheng等人共同完成，其中Shuo Liu、Mengrui Liu和Zhenzhen Wang为共同第一作者，Dashuai Zhu和Ke Cheng为通讯作者。该研究发表于期刊《Nature Biotechnology》（自然生物技术），于2025年9月29日被接收并在线发表，文章编号为s41587-025-02890-8，DOI为https://doi.org/10.1038/s41587-025-02890-8。
本研究的学术背景根植于肿瘤免疫治疗领域，尤其聚焦于免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）在转移性黑色素瘤治疗中面临的重大瓶颈。尽管ICIs已经显著改善了黑色素瘤患者的生存期，但仍有接近40%的患者对治疗无应答。这种耐药性往往由肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中多重免疫抑制信号共同驱动，其中Wnt/β-catenin信号通路的异常激活被认为是导致CD8⁺T细胞排除和ICI耐药的关键机制之一。传统的双特异性抗体或单克隆抗体联合给药策略在临床上虽然展现出一定潜力，但受限于免疫原性、化学计量控制不灵活以及全身暴露所带来的脱靶毒性。因此，开发一种能够同时、按比例、局部靶向肿瘤微环境且能协同阻断PD-L1和Wnt信号的新型递送平台，成为本研究要解决的核心科学问题。本研究的目的是构建一种可吸入的外泌体（exosome）系统，利用Alix分选结构域（Alix sorting domain）实现PD-1与FZD8的串联共展示，从而同时阻断PD-L1和Wnt7b信号，重塑ICI耐药的肿瘤微环境，恢复CD8⁺T细胞功能，并用于治疗ICI耐药的黑色素瘤肺转移。
本研究的实验流程可分为多个层级递进的阶段。第一阶段，作者系统比较了不同外泌体表面展示策略的效率。他们分别利用CD9、CD81、Alix和syntenin等外泌体标志蛋白的分选结构域，构建了多种PD-1融合表达载体，并转导至HEK293T细胞中制备工程化外泌体。通过Western blotting、ELISA、表面等离子体共振、冷冻电镜、单囊泡流式细胞术以及dSTORM超分辨成像等手段，作者证实以Alix的C端片段（418–868氨基酸）作为分选结构域时，PD-1在外泌体外膜上的富集效率最高且分布均匀，超过90%的CD63⁺外泌体表面呈PD-1阳性。随后，作者在皮下BrafV600E/Pten−/−（BP）黑色素瘤模型中，通过瘤内注射比较了不同外泌体的抗肿瘤效果。结果显示PD-1–Alix-exo具有最强的肿瘤抑制能力，其机制在于外泌体表面PD-1能够结合肿瘤细胞上的PD-L1，并促进PD-L1的内吞和降解。第二阶段，作者评估了PD-1–Alix-exo经吸入给药后在小鼠体内的生物分布与抗肿瘤活性。通过Cy5荧光标记和活体成像，作者发现吸入给药后PD-1–Alix-exo在24小时和48小时主要富集于肺部，而肝脏和肾脏的分布显著降低，表明其具有良好的肺靶向性和较低的全身暴露。在肺部定植的BP黑色素瘤模型中，吸入PD-1–Alix-exo显著抑制了肿瘤生长，其疗效优于吸入抗PD-L1抗体或PD-1重组蛋白，甚至优于临床相关剂量下经全身给药的抗PD-L1抗体。第三阶段，作者探讨了Wnt7b–FZD8相互作用在ICI耐药中的作用。通过重新分析接受ICI治疗的转移性黑色素瘤患者RNA测序数据（GSE78220），他们发现Wnt7b和FZD8在无应答患者中显著高表达。免疫共沉淀实验证实Wnt7b与FZD8之间存在直接结合。敲低FZD8可降低Wnt7b诱导的β-catenin激活，抑制ATF3转录，并恢复CCL4表达。在过表达Wnt7b和FZD8的BP肿瘤模型中，抗PD-L1治疗失效，同时肿瘤内CD103⁺树突状细胞和CD8⁺T细胞浸润显著减少。这些结果表明Wnt7b–FZD8信号是ICI耐药的重要驱动因素。第四阶段，作者设计了BEAT（bispecific exosome activators of T cells，双特异性外泌体T细胞激活剂）平台。BEAT利用Alix分选结构域，将FZD8的Wnt结合CDR结构域与信号失活型PD-1以串联方式同时展示于同一外泌体表面，确保PD-1与FZD8以1：1比例共表达。Western blotting和ELISA证实了BEAT表面同时存在PD-1和FZD8。通过Wnt7b蛋白结合实验和PD-L1蛋白结合实验，作者进一步确认了BEAT能够同时与两种配体结合。荧光淬灭实验显示BEAT还可识别携带PD-L1的细胞外囊泡。TCF/LEF荧光素酶报告实验证明BEAT能抑制β-catenin转录活性，下调ATF3并上调CCL4。第五阶段，作者在多种ICI耐药黑色素瘤小鼠模型中验证了BEAT的疗效。在过表达Wnt7b和FZD8的BP肺定植模型中，吸入BEAT显著抑制了肿瘤生长，降低了肺重量，并减少了肿瘤结节，而单独表达PD-1或FZD8的外泌体均无效。与1：1混合的FZD8-exo和PD-1-exo相比，BEAT的串联双特异性设计具有明显优势。在自发肺转移模型中，BEAT同样显示出强大的抗肿瘤活性。在皮下大肿瘤模型（初始体积约200 mm³）中，瘤内注射BEAT仍能有效抑制肿瘤生长。此外，在ICI耐药的肝转移模型中，经静脉注射的BEAT也表现出显著的肝脏趋向性和肿瘤抑制效果。免疫学分析显示，BEAT治疗后肿瘤内CD103⁺树突状细胞和CD8⁺T细胞浸润显著增加，效应CD8⁺T细胞（granzyme B⁺LAG3⁻）比例升高，而耗竭CD8⁺T细胞（PD-1⁺LAG3⁺）比例下降，且BEAT治疗可诱导免疫记忆形成。第六阶段，作者在人源化患者来源异种移植（patient-derived xenograft, PDX）模型中进一步评估了BEAT的疗效。他们使用来自三名不同供体的CD34⁺细胞构建人源化免疫系统小鼠，并植入对pembrolizumab耐药的黑色素瘤PDX组织。结果显示，尽管pembrolizumab在所有供体来源的人源化小鼠中均无效，但BEAT在供体1323和1401来源的小鼠中完全抑制了肿瘤生长，在供体1321来源的小鼠中也显著延缓了肿瘤进展。免疫荧光证实BEAT在体内同时结合PD-L1和Wnt7b。流式细胞术分析发现BEAT治疗增加了肿瘤内CD8⁺T细胞和CD103⁺树突状细胞的浸润，降低了PD-1⁺CD8⁺T细胞和Foxp3⁺调节性T细胞的比例。随后，作者从PDX皮下肿瘤中分离原代肿瘤细胞，构建了人源化小鼠肺定植模型，吸入BEAT同样显著抑制了肺部肿瘤生长，并减少了肿瘤结节数量。第七阶段，作者进行了系统的安全性评价。在人源化小鼠中，吸入BEAT后血清天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、尿素氮和肌酐水平均保持在正常范围内，主要脏器组织学检查未见严重病变。在健康C57BL/6小鼠中，经8周重复给药，抗PD-L1抗体组出现了血糖升高和天冬氨酸氨基转移酶升高，而BEAT组未见上述异常，表明BEAT具有良好的安全性。
本研究的核心结论是：通过Alix分选结构域实现PD-1与FZD8的串联共展示，成功构建了BEAT平台，该平台可经吸入途径高效递送至肺部，同时阻断PD-L1和Wnt7b信号，重塑ICI耐药的肿瘤微环境，恢复CD8⁺T细胞浸润和效应功能，并在多种ICI耐药黑色素瘤模型中展现出强大的抗肿瘤活性和良好的安全性。这一策略不仅为ICI耐药黑色素瘤的治疗提供了新的思路，也为其他ICI耐药肿瘤的外泌体工程化治疗奠定了基础。
本研究的亮点主要体现在以下几个方面：其一，首次利用Alix分选结构域实现了两种治疗性蛋白以1：1比例在同一外泌体表面的串联共展示，解决了传统共表达策略中存在的群体异质性问题；其二，BEAT能够同时结合并促进PD-L1和Wnt7b的内化与降解，而非简单阻断，从而实现了协同且持久的免疫调节；其三，吸入给药途径实现了肺部的高效富集和低全身毒性，相比全身给药的双特异性抗体展现出更优的疗效和安全性；其四，在多种动物模型包括人源化PDX模型中验证了疗效，增强了临床转化前景。此外，该技术平台具有通用性，未来可扩展至其他ICI耐药肿瘤类型。