一、研究概况
本研究主要由St. Jude儿童研究医院的Kai Yang、Hongbo Chi等研究人员，联合马萨诸塞大学医学院、利物浦大学等机构共同完成。研究成果以“mTORC1在代谢重编程中调控静息期T细胞活化和Th2细胞分化”为题，于2013年12月12日发表在学术期刊《免疫》（*Immunity*）上。
二、学术背景
本研究属于免疫学和细胞代谢学的交叉领域。成熟的初始T细胞在体内处于静息状态，细胞代谢水平很低。当遭遇抗原刺激时，T细胞会活化、克隆扩增并分化为效应细胞，同时伴随着显著的代谢活动增强，如糖酵解。然而，尽管对T细胞受体早期信号转导（如NF-κB和MAPK激活）以及随后的克隆扩增和分化过程有广泛了解，但将这些过程连接起来的机制尚不明确。从静息状态过渡到细胞周期启动这一关键步骤，尤其是在长达24小时以上的准备期中发生的代谢重组，其调控原理和功能意义是一个亟待解决的核心问题。
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）是细胞生长和代谢的中心调控者。既往研究提示mTORC1在T细胞分化（如Th1、Th17）中起作用，但其在T细胞激活早期，特别是调控代谢重组和“退出静息”过程的具体机制和生理学意义存在争议且不清晰。例如，使用雷帕霉素抑制mTORC1或缺失其上游激活因子Rheb，对T细胞增殖的影响相对温和，且被认为不影响Th2细胞分化。这促使研究者思考，是否存在其他上游信号或mTORC1的独立功能来主导这一关键过渡期。
因此，本研究的目的是：阐明mTORC1在T细胞应答中的核心生理学作用；揭示其如何通过整合TCR/CD28信号，启动代谢重组，从而驱动T细胞退出静息状态；并探究这一过程如何影响后续的细胞命运决定，特别是Th2细胞的分化。
三、详细研究流程
研究采用了一种系统性、多层次的方法，从基因敲除小鼠模型出发，结合体外功能分析、体内免疫应答模型以及深入的分子机制探索。
1. 构建和组织特异性敲除小鼠模型 研究团队首先使用了loxP-flanked Rptor (编码Raptor蛋白) 基因的小鼠，与表达CD4-Cre的小鼠杂交，获得在T细胞中特异性敲除*Rptor*的小鼠（称为Rptor-/-）。这确保了mTORC1复合物的功能在T细胞中特异性丧失，避免了全身性敲除或药物（如雷帕霉素）非特异性影响的混淆。作为对照和机制比较，研究还使用了同样方法构建的T细胞特异性Rictor (编码Rictor， mTORC2复合物的关键组分) 敲除小鼠（Rictor-/-），以及两者双敲除小鼠。研究中还提及了使用Rheb条件性敲除小鼠进行对比。
2. 体外T细胞功能分析 从上述基因工程小鼠中分离纯化初始CD4+ T细胞（CD62Lhi CD44lo CD25-），进行一系列体外刺激和培养实验。 * 激活与增殖分析：使用抗CD3和抗CD28抗体模拟抗原刺激，通过[³H]胸腺嘧啶核苷掺入法、CFSE染色稀释法评估细胞增殖；通过流式细胞术检测细胞因子IL-2的产生和分泌，以及活化/记忆表型标记物（CD44、CD62L）。 * 细胞周期与生长分析：在刺激后特定时间点，使用BrdU掺入法检测进入S期的细胞比例；通过前向散射光（FSC）测量细胞大小（生长）；通过流式细胞术检测营养转运受体CD98和铁转运受体CD71的表达。 * 代谢活性测定： * 糖酵解：使用[3-³H]-葡萄糖脱氚法，精确测量糖酵解通量。 * 脂质合成：通过[1-¹⁴C]乙酸掺入法，测量T细胞刺激后新生脂质（包括胆固醇和脂肪酸）的合成速率。 * 氧化磷酸化：使用Seahorse XF24-3细胞外流量分析仪，实时测量细胞的耗氧率。 * Th2细胞分化分析：在Th2极化条件下（存在IL-2、IL-4， 阻断IFN-γ）培养初始T细胞。培养5-6天后，用PMA/离子霉素重刺激，通过细胞内染色和流式细胞术检测IL-4、IFN-γ的产生；或用抗CD3重刺激后，通过Luminex多因子检测或qPCR测量细胞因子分泌和mRNA水平。 * 早期分化事件分析：在Th2极化条件下刺激24小时，通过流式细胞术分析细胞因子受体（如IL-4Rα, IL-2Rα）的表达；通过磷酸化流式细胞术检测下游信号分子（如STAT6， STAT5）的活化状态。
3. 体内免疫应答模型 * 适应性免疫应答：用表达卵清蛋白的重组李斯特菌感染小鼠，评估体内抗细菌免疫应答。之后分离脾细胞，用特异性肽段重刺激，通过细胞内细胞因子染色和MHC I类四聚体染色，检测抗原特异性IFN-γ+ CD4+和CD8+ T细胞的数量和比例。 * Th2依赖性过敏性疾病模型：用卵清蛋白加氢氧化铝佐剂致敏小鼠，再通过卵清蛋白雾化吸入激发，建立过敏性气道炎症模型。评估指标包括：肺组织病理学切片炎症评分；支气管肺泡灌洗液和肺组织中各类免疫细胞（嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、树突状细胞、T细胞）的浸润数量；BALF中IL-4水平和血清OVA特异性IgE抗体水平。 * 过继转移与体内增殖：将CFSE标记的初始T细胞（来自OT-II TCR转基因背景的野生型或Rptor-/-小鼠）过继转移到同种异体CD45.1+宿主小鼠体内，然后用特异性肽段免疫，分析引流淋巴结中供体T细胞的扩增（数量）和增殖（CFSE稀释）。 * 淋巴细胞减少诱导的增殖：将CFSE标记的初始T细胞分别过继转移到亚致死剂量照射的宿主或未处理的Rag1-/-小鼠体内，诱导稳态增殖或自发增殖，评估Raptor缺失对非抗原依赖性增殖的影响。
4. 分子机制与信号通路分析 * 信号转导：通过蛋白质免疫印迹技术，检测TCR/CD28刺激后，mTORC1下游靶点（S6K1， S6， 4E-BP1）的磷酸化状态，以及其他信号通路（Akt Ser473， ERK， IκBα）的活化情况。 * 转录组学分析：对TCR/CD28刺激0、8、24小时的野生型和Rptor-/- T细胞进行全基因组微阵列分析。这是本研究的核心方法之一。数据分析包括：筛选差异表达基因；进行基因集富集分析（GSEA），以无偏倚的方式识别受Raptor调控的生物学通路；使用基因本体论（GO）分析对差异基因进行功能分类。相关数据已上传至基因表达综合数据库。 * 基因表达验证：通过实时定量PCR验证微阵列分析中发现的差异表达基因，包括细胞周期相关基因（Cyclin D2， E， CDKs）、糖酵解酶基因（HK2， LDHA， TPI1）、脂质合成相关基因（HMGCS1， HMGCR， SQLE， FASN， SCD1/2）以及关键转录因子（c-Myc， SREBF1/2）。 * 蛋白质水平分析：通过蛋白质免疫印迹检测c-Myc、SREBP1/2（包括全长和成熟形式）的蛋白表达水平。
5. 药理学干预与时间动力学实验 为区分mTORC1在“退出静息”阶段与“持续增殖”阶段的作用，研究设计了精巧的时间依赖实验。在T细胞激活的不同时间点（如0， 24， 48小时）加入雷帕霉素或更高效的mTOR抑制剂Torin1/PP242，然后在固定时间点（如加药后24小时）评估BrdU掺入或细胞增殖。同样，使用糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖（2-DG）在不同时间点处理，以评估葡萄糖代谢对细胞周期进入和Th2分化的动态需求。
四、主要研究结果
1. Raptor缺失严重损害T细胞激活、增殖及体内免疫应答。 Rptor-/-小鼠胸腺发育正常，但外周T细胞稳态，尤其是CD8+ T细胞，略有改变。体外实验中，Raptor缺失几乎完全阻断了TCR/CD28诱导的IL-2产生和增殖（CFSE稀释和³H-TdR掺入均显著降低），且这种缺陷不能被外源IL-2纠正。这种增殖缺陷在抗原特异性（OT-II过继转移）、细菌感染模型和淋巴细胞减少诱导的增殖模型中均得到证实，表明Raptor对于T细胞启动是绝对必需的。
2. Raptor在T细胞应答中的重要性远超Rictor和Rheb。 直接对比显示，Rictor缺失对T细胞增殖和体内抗细菌免疫应答的影响远小于Raptor缺失，且Rptor/Rictor双敲除的表现与Raptor单敲除类似。这表明在T细胞启动中，mTORC1的作用占主导地位。更重要的是，与既往认为mTORC1不影响Th2分化的观点相反，Raptor缺失严重损害了体外Th2分化和体内过敏性气道炎症反应。而Rheb缺失仅导致轻度的增殖缺陷，且不影响Th2分化（与文献一致）。这强烈提示存在不依赖于Rheb的mTORC1激活途径来驱动关键功能。
3. Raptor-mTORC1主要调控从静息期进入细胞周期的过程，而非持续增殖。 深入的机制研究表明，Raptor缺失的T细胞在刺激后无法有效进入S期（BrdU掺入极少），细胞生长（体积增大）和营养受体（CD98， CD71）上调受损。全基因组分析显示，刺激24小时后，Raptor缺失导致大量细胞周期相关基因的表达未能被诱导。然而，一旦T细胞已经启动并进入活跃的细胞周期（表现为CFSE已经稀释的细胞），再删除Raptor或此时加入mTOR抑制剂，对它们继续进入S期（BrdU掺入）的影响就很小。时间动力学实验也证实，雷帕霉素在激活起始时加入抑制效果最强，而在激活24或48小时后加入则效果甚微。这些数据共同证明，Raptor-mTORC1的核心功能是驱动T细胞从静息态（G0）向第一个细胞周期的“启动”，而非维持已经活化细胞的快速周期循环。
4. Raptor-mTORC1协调激活T细胞的多重代谢程序。 这是本研究的核心发现。微阵列和GSEA分析揭示了Raptor在T细胞激活中广泛的代谢调控作用： * 糖酵解：Raptor缺失的T细胞在TCR刺激后，糖酵解通量上调受阻，关键糖酵解酶和转录因子c-Myc的诱导表达（蛋白水平）受损。 * 脂质合成：刺激8小时后，Raptor缺失导致胆固醇和脂肪酸合成途径的基因表达谱显著下调。功能实验证实其新生脂质合成能力下降。调控脂质合成的关键转录因子SREBP1/2的蛋白水平（尤其是成熟活性形式）在Raptor缺失细胞中诱导不足，但其mRNA水平不受影响，提示Raptor在翻译后水平调控SREBP。 * 氧化磷酸化：GSEA显示氧化磷酸化相关基因集下调，Seahorse分析证实其耗氧率降低。 因此，Raptor-mTORC1像一个“代谢总指挥”，在T细胞激活早期同时上调糖酵解、脂质合成和线粒体呼吸，为细胞周期的启动提供全面的物质和能量准备。
5. mTORC1通过将葡萄糖代谢与细胞因子反应性耦联来启动Th2细胞分化。 研究发现，mTORC1对Th2分化的调控与其对增殖的调控部分分离。抑制糖酵解（2-DG）即使在不太影响增殖的剂量下也能强烈抑制Th2分化，且早期抑制效果更显著。机制上，Raptor缺失的T细胞在Th2极化早期（24小时）无法有效上调关键细胞因子受体IL-4Rα和IL-2Rα，导致其下游STAT6和STAT5的磷酸化活化受损。这种受体表达缺陷可被2-DG或雷帕霉素（而非胆固醇合成抑制剂25-HC）模拟，并且降低培养基中的葡萄糖浓度也会导致IL-4Rα诱导减少。这表明，mTORC1依赖的葡萄糖代谢是诱导Th2分化所需细胞因子反应性的上游开关。
6. Raptor整合TCR和CD28信号以维持mTORC1活化和代谢重组。 CD28共刺激能显著增强TCR诱导的长期（18小时）mTORC1活化（S6K1/S6磷酸化）和糖酵解。这种由TCR/CD28协同诱导的、持续性的mTORC1活化不依赖于Rheb（Rheb缺失只影响早期活化）和mTORC2（Rictor缺失不影响mTORC1活化）。这解释了为什么Raptor缺失的表型如此严重，因为它整合了TCR和CD28这两个关键的启动信号，并通过一条不依赖于经典Rheb的途径来维持mTORC1活性，从而驱动代谢重组。
五、结论与价值
本研究得出了一个清晰而重要的结论：Raptor-mTORC1介导的信号依赖性代谢重编程，是驱动初始T细胞退出静息状态的核心决定因素。这一“退出静息”过程，进而协调了随后的淋巴细胞克隆扩增和命运决定（特别是Th2细胞分化）。
其科学价值在于： 1. 概念创新：首次明确了“退出静息”作为一个由特定分子通路（mTORC1）控制的、独立的、代谢驱动的关键过渡阶段，它连接了早期TCR信号和后续的增殖/分化。这深化了对适应性免疫启动基本规律的理解。 2. 机制突破：揭示了mTORC1在T细胞中作为代谢整合中心的功能，阐明了其通过协调糖酵解、脂质合成等多重代谢程序来支持细胞周期启动的详细机制。特别是发现了mTORC1通过葡萄糖代谢调控细胞因子受体表达，从而将代谢状态与免疫细胞命运决定直接联系起来的新机制。 3. 澄清争议：通过遗传学手段明确了Raptor-mTORC1在T细胞激活和Th2分化中不可替代的主导作用，纠正了仅基于Rheb缺失或雷帕霉素抑制所得出的片面认识，揭示了不依赖于Rheb的mTORC1激活通路在生理免疫应答中的重要性。 4. 应用潜力：为通过靶向代谢通路来调节免疫应答（如增强疫苗效果或治疗过敏、自身免疫疾病）提供了新的理论基础和潜在的干预靶点。
六、研究亮点