针对代谢功能障碍相关脂肪性肝炎的纤维化治疗新策略：体内生成靶向FAP的CAR-T细胞可减轻纤维化并恢复肝脏稳态

一、 研究团队与发表信息

本研究的主要作者是Chittampalli N. Yashaswini，通讯作者为Scott L. Friedman。研究团队来自多个知名机构，包括美国西奈山伊坎医学院肝脏疾病科、肿瘤科学系、Tisch癌症研究所，宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院细胞与发育生物学系、心血管研究所，以及PharmaNest公司、Capstan Therapeutics公司、瑞典卡罗林斯卡学院等。该研究成果于2026年1月21日发表在*Science Translational Medicine*期刊上（卷18，文章号eadx0368）。

二、 学术背景与研究目的

研究领域： 本研究属于肝脏疾病，特别是代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（Metabolic dysfunction-associated steatohepatitis， MASH）纤维化治疗的转化医学研究领域。MASH是代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD，旧称非酒精性脂肪性肝病）的严重形式，以肝脏炎症、肝细胞气球样变和纤维化为特征，可进展为肝硬化、肝细胞癌，是全球范围内最常见的慢性肝病之一。肝脏纤维化是MASH患者死亡率的关键预测指标，主要由活化的肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells， HSCs）驱动。

研究背景与动机： 目前，MASH尚无获批的抗纤维化疗法。HSCs是肝脏主要的促纤维化细胞类型，在健康肝脏中呈静息状态，储存维生素A并维持肝脏稳态；在肝损伤时，HSCs被激活，大量增殖并产生细胞外基质（ECM），导致纤维化。单细胞技术揭示HSCs存在显著的异质性，因此，选择性清除致病的HSCs亚群，同时保留具有稳态功能的静息HSCs，是治疗肝纤维化的理想策略。成纤维细胞活化蛋白α（Fibroblast Activation Protein alpha， FAP）是一种主要在活化基质细胞（包括活化的HSCs）表面表达的丝氨酸蛋白酶，在人类和鼠类MASH中特异性表达于HSCs，是潜在的治疗靶点。

嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T cells， CAR-T）疗法在癌症治疗中已取得成功，但其在非肿瘤性疾病（如纤维化）中的应用面临挑战。传统的体外生成CAR-T细胞可能长期存在，持续清除非恶性细胞可能导致稳态功能受损。因此，开发一种瞬时、可控的CAR-T细胞疗法至关重要。

研究目的： 本研究旨在探索一种新型的、体内生成的抗FAP CAR-T细胞疗法，用于治疗MASH相关的肝纤维化。具体目标包括：1) 验证FAP在人和小鼠MASH肝脏HSCs中的特异性表达；2) 评估体内生成的抗FAP CAR-T细胞在MASH小鼠模型中的抗纤维化效果；3) 阐明该疗法除直接清除FAP+ HSCs外，是否通过非细胞自主性作用影响其他肝脏细胞（如免疫细胞、内皮细胞、肝细胞），从而恢复肝脏稳态。

三、 详细研究流程

本研究是一项系统性的临床前研究，流程严谨，包含多个相互关联的实验环节。

1. 靶点验证与动物模型建立： * 研究对象： 使用“纤维化与肿瘤”（Fibrosis and Tumor， FAT）MASH小鼠模型，该模型通过高脂高糖饮食联合低剂量四氯化碳（CCl4）注射，能很好地模拟人类MASH的病理特征，包括脂肪变性、炎症和进行性纤维化。同时，分析了人类MASH患者的肝脏样本。 * 实验方法： * 免疫荧光/免疫组化： 对小鼠和人类MASH肝脏组织进行FAP与HSCs标志物（如胶质纤维酸性蛋白GFAP）的共定位染色，证实FAP在HSCs上的表达。 * 单核RNA测序（single-nuclear RNA sequencing， snRNA-seq）： 分析已发表的以及本研究生成的MASH肝脏snRNA-seq数据集，在单细胞分辨率下确认FAP mRNA的表达主要富集于活化的HSCs及其前体细胞亚群，而在其他肝脏细胞类型中表达极低或缺失。这从转录组水平确立了FAP作为靶向HSCs的特异性分子。

2. 体内CAR-T细胞疗法构建与验证： * 核心技术： 采用靶向脂质纳米颗粒（Targeted Lipid Nanoparticles， T-LNPs）递送mRNA的技术。具体而言，将编码抗FAP CAR的mRNA封装在表面缀有抗CD5抗体的T-LNPs中（CD5-FAPCAR T-LNPs）。CD5是T细胞表面的标志物，因此该T-LNPs能特异性靶向T细胞。作为对照，使用了装载无关报告蛋白mCherry mRNA的CD5靶向T-LNPs（CD5-mCherry），或装载FAPCAR mRNA但表面缀有非靶向IgG的T-LNPs（IgG-FAPCAR）。 * 治疗策略： 在FAT MASH模型诱导6周（此时已出现显著纤维化）后，通过尾静脉注射单剂量的CD5-FAPCAR T-LNPs或对照T-LNPs/生理盐水，模拟治疗性干预而非预防性干预。 * CAR-T细胞生成与功能验证（注射后18小时分析）： * 流式细胞术： 分析脾脏和肝脏免疫细胞。结果显示，CD5-FAPCAR处理组小鼠的脾脏和肝脏中成功检测到FAPCAR+ T细胞（CD4+和CD8+），而IgG-FAPCAR对照组中几乎检测不到，证明了T-LNPs靶向CD5+细胞的特异性。 * 激活与耗竭标志物检测： 在肝脏中，一部分FAPCAR+ CD8+ T细胞表达CD107a（脱颗粒标志，提示近期发挥效应功能），约10%的CAR-T细胞表达早期激活标志CD69，而程序性死亡蛋白1（PD-1，耗竭标志）表达水平很低。这表明体内生成的抗FAP CAR-T细胞是活化的、非耗竭的，并能在富含FAP靶点的损伤肝脏微环境中立即发挥功能。

3. 抗纤维化疗效评估（注射后30天分析）： * 组织学与数字化病理分析： * 天狼星红染色： 定量分析胶原沉积面积。结果显示，与CD5-mCherry对照组相比，CD5-FAPCAR治疗组小鼠肝脏的胶原面积显著减少。 * 人工智能（AI）平台（FibroNest）分析： 这是一个高分辨率单纤维AI分析平台，能精细量化纤维化的表型。分析显示，CD5-FAPCAR治疗不仅减少了总的胶原含量，更显著降低了结构复杂的“组装型”胶原纤维的比例和纤维化结构的复杂性。 * 免疫印迹（Western Blot）与免疫荧光： 检测纤维化相关蛋白。治疗组肝脏的I型胶原（Col1a1）和α平滑肌肌动蛋白（αSMA，活化的HSCs标志物）蛋白水平显著降低。 * HSCs亚群分析： * 流式细胞术与t-SNE降维分析： 分析非实质细胞（CD45- CD31-）中的HSCs（αSMA+）。结果显示，CD5-FAPCAR治疗组中αSMA+细胞数量减少。通过标记物（αSMA, Ki-67, CD206）进一步将HSCs分为静息样、活化样和衰老样亚群。治疗促进了HSCs亚群的有利重分布：活化样HSCs比例降低，而静息样和衰老样HSCs比例相对增加。 * snRNA-seq分析： 对治疗后的肝脏进行snRNA-seq，确认FAP表达在治疗组HSCs中降低。对HSCs进行亚聚类分析发现，治疗组中“活化HSCs”和“静息前体活化HSCs”的比例下降，而“静息HSCs”和“衰老HSCs”的比例上升，与流式结果一致。这直接证明体内抗FAP CAR-T疗法能选择性清除致纤维化的HSCs亚群。

4. 对非HSCs肝脏细胞的影响（非细胞自主性效应）： * 免疫细胞： * 巨噬细胞： 流式分析显示，治疗组肝脏中活化的（CD69+, CD86+）Ly6C低单核细胞来源的巨噬细胞（具有抗炎、促纤维化消退特性）比例增加。 * T细胞： 治疗组肝脏中PD-1+ CD4+ T细胞（耗竭T细胞）比例下降，特别是其中具有增殖潜能的“祖细胞耗竭”CD4+ T细胞亚群显著减少，表明疗法能改善CD4+ T细胞的耗竭状态。 * 肝窦内皮细胞（Liver Sinusoidal Endothelial Cells， LSECs）： 流式显示治疗组LSECs（CD45- CD31+）数量增加。snRNA-seq分析发现，治疗组内皮细胞中与血管发育和稳态维持相关的基因（如Atp5l, *Glul*）表达上调，而与病理性血管生成和癌症相关的基因（如Fmnl2, *Insr*）表达下调，提示内皮细胞功能向健康状态恢复。 * 肝细胞： * snRNA-seq与基因本体（GO）分析： 治疗组肝细胞中，与脂肪酸代谢、甘油三酯合成和胰岛素反应相关的多个基因（如Dgat2, Cpt1a, Scd1, Tm6sf2, *Apoa4*）表达下调。尤其值得注意的是，与MASH进展相关的细胞色素P450 4A14（*Cyp4a14*）基因表达在治疗组显著降低，接近健康对照水平。GO分析表明，对照组肝细胞高表达基因富集于脂质代谢紊乱相关通路，而治疗组肝细胞高表达基因则富集于核苷酸代谢等基础生理过程。此外，调控ECM沉积的*Sox9*基因表达也下降。 * 这些结果表明，清除FAP+ HSCs能间接重编程肝细胞的基因表达谱，使其从脂质代谢异常状态向更健康的代谢表型转变。

5. 安全性与持久性评估： * 生化指标与器官重量： 治疗后30天，小鼠的血清转氨酶（AST, ALT）、白蛋白、胆固醇、胆红素水平，以及肝脏和脾脏重量均无显著变化，表明疗法无明显肝毒性或全身毒性。 * CAR-T细胞持续性： 流式细胞术检测显示，在治疗后30天，脾脏和肝脏中已无法检测到FAPCAR+免疫细胞，证明了该基于mRNA的体内CAR-T细胞疗法的瞬时性。

四、 主要研究结果

1. FAP是MASH中HSCs的特异性靶点： 在人和小鼠MASH中，FAP蛋白和mRNA表达均特异性局限于活化的HSCs及其前体细胞，而在健康肝脏或其他肝细胞类型中表达极低，这为其作为治疗靶点提供了依据。
2. 体内成功生成功能性抗FAP CAR-T细胞： 静脉注射CD5靶向的FAPCAR mRNA T-LNPs后18小时，可在脾脏和肝脏中高效、特异性地生成FAPCAR+ T细胞。这些细胞处于活化状态（表达CD69），具备效应功能（表达CD107a），且未呈现耗竭表型（低PD-1表达）。
3. 显著减轻肝纤维化： 单次治疗后30天，多种检测方法（天狼星红染色、AI数字化病理、免疫印迹）一致显示，治疗组小鼠肝脏纤维化程度显著减轻，胶原沉积减少，纤维结构复杂性下降。
4. 选择性清除致纤维化HSCs亚群： 流式细胞术和snRNA-seq分析证实，疗法特异性地减少了活化的、促纤维化的HSCs亚群（高表达FAP），同时相对增加了静息和衰老的HSCs比例，实现了对致病细胞的精准清除，同时保留了可能具有稳态功能的HSCs。
5. 引发广泛的非细胞自主性有益效应： 疗法不仅直接靶向HSCs，还通过改变肝脏微环境，产生了多方面的间接益处：
   • 调节免疫： 促进具有抗炎、促修复功能的Ly6C低单核细胞来源巨噬细胞活化；减少耗竭性CD4+ T细胞。
   • 修复血管： 增加LSECs数量，并使其基因表达谱向健康状态恢复。
   • 改善肝细胞代谢： 下调肝细胞中与脂肪变性、胰岛素抵抗相关的基因，上调基础代谢通路基因，提示肝细胞脂质代谢和整体功能得到改善。
6. 疗法安全且瞬时： 治疗未引起明显的肝损伤或全身毒性指标异常。生成的CAR-T细胞是瞬时的，在治疗后30天已从体内清除，降低了长期脱靶效应的风险。

五、 结论与意义

结论： 本研究证明，通过靶向CD5的T-LNPs在体内瞬时生成抗FAP CAR-T细胞，是一种有效且安全的治疗MASH肝纤维化的新策略。该疗法通过直接清除表达FAP的致纤维化HSCs亚群来减少胶原沉积，同时通过间接（非细胞自主性）作用，重塑肝脏免疫环境、修复内皮功能、改善肝细胞代谢紊乱，从而多维度地促进纤维化消退和肝脏稳态恢复。

科学价值与应用前景： * 概念创新： 首次将体内生成、瞬时作用的mRNA CAR-T细胞技术成功应用于MASH肝纤维化治疗，为纤维化疾病乃至其他非恶性疾病的细胞疗法开辟了新途径。 * 机制深入： 超越了单纯“细胞清除”的视角，系统揭示了靶向HSCs如何通过复杂的细胞间通讯网络，引发广泛的肝脏微环境重编程，最终实现疾病缓解。这深化了对肝脏纤维化发生与逆转机制的理解。 * 治疗潜力： 为解决MASH这一无药可治的全球健康难题提供了全新的治疗思路。其瞬时特性避免了传统CAR-T长期存在的风险，更具安全性。靶向FAP也可能适用于其他器官（如心、肾）的纤维化治疗。 * 转化意义： 为开发基于mRNA和靶向递送技术的下一代抗纤维化药物奠定了坚实的临床前基础。

六、 研究亮点

1. 靶点选择精准： 基于单细胞测序数据，选择在MASH中特异性表达于致病HSCs亚群的FAP作为靶点，实现了对病变细胞的精准打击。
2. 技术平台先进： 创新性地应用了体内生成CAR-T细胞的技术平台（靶向T细胞的mRNA LNP），实现了CAR-T疗法的“即用型”、可控和瞬时作用，克服了传统体外制备CAR-T在纤维化治疗中可能存在的持久性风险。
3. 疗效机制全面： 不仅证实了直接抗纤维化效果，更利用多组学技术（流式、snRNA-seq）和先进分析工具（AI病理平台）深入阐明了疗法对肝脏内多种细胞类型（免疫细胞、内皮细胞、肝细胞）产生的广泛有益影响，揭示了其“多效性”治疗机制。
4. 研究设计严谨： 采用了治疗性干预模型（在纤维化已形成后给药），更贴近临床实际情况。设置了多个严谨的对照组（疾病对照、载体对照、非靶向CAR对照、报告基因对照），并综合运用了组织学、分子生物学、细胞免疫学和高通量测序等多种技术进行全方位验证。
5. 安全性与持久性数据充分： 明确展示了该疗法的良好安全性和CAR-T细胞的瞬时存在特性，为其未来的临床转化提供了重要的安全性依据。

七、 其他有价值的内容

研究也指出了当前工作的局限性及未来方向：包括长期疗效和肝脏再生影响的未知性、在晚期严重纤维化中的疗效有待验证、LNP载体本身对肝脏生物学的潜在影响需进一步评估，以及FAPCAR疗法对其他MASH相关器官（如心、肾）的影响值得探索。这些为后续研究指明了方向。

这项研究是一项融合了前沿生物技术、精准靶向策略和系统生物学分析的典范工作，为开发MASH及其他纤维化疾病的革命性疗法带来了重大希望。