本研究由 Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) 的 Inwon Park、Mingyo Kim 和 Pilhan Kim 等人联合 Seoul National University Bundang Hospital (SNUBH) 及 Institute for Basic Science (IBS) 的多位研究者共同完成。Pilhan Kim 和 Gou Young Koh 为共同资深作者。该原创性研究成果于 2019 年发表在 European Respiratory Journal 上。
研究背景
脓毒症是全球范围内住院患者死亡的主要原因之一，其特征是宿主对入侵病原体产生失调反应，引发血流动力学改变，进而导致多器官功能障碍。在众多受累器官中，肺是最早且最常衰竭的器官。脓毒症引发的急性肺损伤，在临床上被称为急性呼吸窘迫综合征，是患者死亡的关键预后因素。然而，尽管针对脓毒症所致急性呼吸窘迫综合征的治疗研究投入巨大，但目前除肺保护性通气策略外，尚无能够直接改善通气-血流比值失调的微循环靶向疗法。“死腔”作为评估急性呼吸窘迫综合征的一个重要指标，指通气但无灌注的肺泡区域，但其与肺微循环损伤的具体关联及形成机制一直不甚明确。已有离体研究发现了肺血管中存在血栓的证据，但无法揭示中性粒细胞在体内向肺内涌入及其扰乱微循环的动态过程。由于肺毛细血管的直径小于中性粒细胞，中性粒细胞必须通过变形才能缓慢通过，这一现象被称为中性粒细胞隔离。虽然此前已观察到肺毛细血管中存在中性粒细胞隔离，但其如何进展为急性呼吸窘迫综合征的机制始终是未解之谜。因此，本研究旨在探究脓毒症诱导的急性肺损伤中肺微循环的扭曲情况，并揭示其背后的细胞病理生理机制。
研究流程与方法
为了突破传统研究手段的限制，研究者首先搭建了一套定制的视频速率激光扫描共聚焦显微镜系统，并结合一种基于微吸力的肺部成像窗口，实现了对活体小鼠肺微循环及循环细胞的直接、实时可视化。这是本研究的关键性技术创新，为在体观察肺深部血管内细胞的动态行为提供了可能。研究的对象主要包括 C57BL/6N 背景的野生型小鼠、内皮细胞特异性表达绿色荧光蛋白的 Tie2-GFP 转基因小鼠，以及在骨髓细胞中表达绿色荧光蛋白的 LysM-GFP/+ 报告基因小鼠。研究者通过腹腔注射高剂量脂多糖或实施高阶盲肠结扎穿刺手术来构建脓毒症诱导的急性肺损伤小鼠模型。具体的实验流程与分析方法如下：
功能性毛细血管比率参数的建立与评估：研究者首先从供体 Tie2-GFP 小鼠心脏采血，用荧光染料 DiD 标记红细胞，再通过尾静脉过继转移到同系受体小鼠体内。利用活体肺成像系统，研究者能够实时追踪 DiD 标记的红细胞在 GFP 标记的肺血管内的流动轨迹和速度。为了量化肺微循环的灌注状态，研究者发明了一项名为“功能性毛细血管比率”的量化参数。通过对 600 至 900 帧的连续成像进行最大强度投影，能够区分出有红细胞灌注的“功能性毛细血管区域”和无灌注的“总毛细血管区域”，功能性毛细血管比率即为这两者的面积之比。实验在对照组和脂多糖处理 6 小时后的小鼠中进行，每组 3 只小鼠，每只小鼠采集 10 个视野，共计 30 个视野，以此为基础进行统计分析。
识别微循环障碍元凶并分析中性粒细胞动态行为：在测量功能性毛细血管比率时，研究者观察到毛细血管阻塞现象。为验证阻塞物是否为中性粒细胞，研究者使用 LysM-GFP/+ 小鼠进行实时成像。为定量分析单个中性粒细胞的动态行为变化，研究者分别在给予脂多糖后 3 小时和 6 小时，进行了长达 30 分钟的延时摄影，对照组和实验组各使用 3 只小鼠。通过分析软件 Imaris，研究者追踪了数百个中性粒细胞的运动轨迹，并量化了其隔离时间、位移长度、轨迹长度、平均速度和蜿蜒指数等运动学参数。
活体观察死腔形成与活性氧的产生：在确认中性粒细胞阻塞血管的基础上，研究者在脂多糖给药后 3 至 6 小时的时间窗内，使用活体成像直接捕捉了死腔形成的完整动态过程。他们实时观察了中性粒细胞在毛细血管及连接毛细血管的小动脉分支区域如何聚集、阻塞血管并中断血流。同时，为了解被捕获的中性粒细胞的功能状态，研究者通过尾静脉注射二氢乙锭，这是一种能在体内被活性氧氧化并发光的探针，从而在活体原位检测中性粒细胞的活性氧产量。
验证中性粒细胞的核心作用并通过流式细胞术寻找治疗靶点：为确认中性粒细胞在微循环障碍中的核心地位，研究者在脂多糖注射前 24 小时给小鼠腹腔注射 Ly6G 特异性单克隆抗体以耗竭中性粒细胞。在耗竭和不耗竭中性粒细胞两种情况下，比较了假手术组和脂多糖组小鼠（每组 3 只）的肺功能性毛细血管比率。考虑到中性粒细胞耗竭疗法在临床转化上的困难，研究者进一步探究了针对隔离中性粒细胞亚群的药物靶点。他们采用流式细胞术，对同一只小鼠的左心室血液和消化后的肺组织中的中性粒细胞进行配对比较，每实验组 5 只小鼠，分析了整合素 CD11a、CD11b、CD18 和 CD62L 在两个部位中性粒细胞表面的表达差异。
评估 Mac-1 抑制剂对肺微循环的恢复效果：基于流式细胞术的发现，研究者测试了 Mac-1 抑制剂的效果。他们在盲肠结扎穿刺术诱导的多菌性脓毒症模型中，于术后给予抗 CD11b 抗体、Abciximab 或同型对照抗体治疗，并比较了假手术组和各治疗组小鼠的肺功能性毛细血管比率。为进一步确证，研究者还对同一只 Abciximab 治疗小鼠，在静脉注射药物前后同一部位的肺功能性毛细血管比率的变化进行了前后自身对照分析。最后，通过左心室动脉血气分析，验证了微循环改善是否转化为气体交换功能的提高。
主要研究结果
在脂多糖诱导的脓毒症急性肺损伤小鼠中，尽管红细胞平均流速未发生显著变化，但其灌注模式发生了剧烈改变。与对照组弥漫、广泛的灌注分布相反，脂多糖组小鼠的红细胞灌注变得集中，且与少数小动脉和毛细血管重叠。通过量化分析，研究首次直接证实：脓毒症急性肺损伤早期的功能性毛细血管比率显著下降，这为肺微循环存在灌注异质性提供了直接证据。这些功能性毛细血管比率的下降与动脉血气分析显示的严重低氧血症和高碳酸血症结果相吻合。
活体实时成像揭示了功能性毛细血管比率下降的直接原因。在 LysM-GFP/+ 小鼠中，正常的肺毛细血管内存在短暂的中性粒细胞“捕获-变形-通过”现象，血流会短暂中断后恢复。然而，在脓毒症模型中，大量中性粒细胞被长时间捕获在毛细血管中，导致血流持续中断。对数百个中性粒细胞运动轨迹的量化分析显示，随着炎症进展，中性粒细胞的隔离时间显著延长，其运动行为呈现出“先活化后停滞”的特征：在脂多糖注射后 3 小时，被隔离的中性粒细胞运动性增强，表现为轨迹更长、速度更快；但到 6 小时后，细胞运动性显著下降，趋于停滞，这正是聚集和阻塞的力学基础。
利用活体成像，研究首次动态记录了死腔形成的完整过程：一个循环中的中性粒细胞被一个已固定的中性粒细胞捕获，导致两者之间的毛细血管血流停滞，形成死腔。这种现象不仅发生在毛细血管，也发生在连接毛细血管的小动脉分叉处，阻塞迅速发生并严重扰乱该区域的微循环。通过将中性粒细胞成像与红细胞灌注示踪相结合，直接证实了中性粒细胞簇所在之处即是“死腔”所在之处。此外，研究者首次在活体内观察到，停滞在肺血管内的中性粒细胞原位产生活性氧，其数量和比例在脓毒症小鼠中急剧增加，暗示它们在渗出血管前就已可能对周围内皮细胞和血管结构造成损伤。
中和实验表明，耗竭中性粒细胞能显著提高脓毒症小鼠的肺功能性毛细血管比率，直接证明了中性粒细胞是造成微循环阻塞的核心成分。流式细胞术结果显示，在脓毒症状态下，中性粒细胞表面的 Mac-1 整合素表达普遍上调。更重要的是，在同一脓毒症小鼠体内，肺部隔离的中性粒细胞表面的 CD11b 和 CD18 表达水平显著高于左心室循环中的中性粒细胞。活体成像也直观验证了这一发现，确认被捕获在肺内的中性粒细胞高表达 Mac-1。
最后，在盲肠结扎穿刺术脓毒症模型中，使用 Mac-1 抑制剂能显著恢复肺功能性毛细血管比率，并减少被隔离的中性粒细胞数量。同一部位治疗前后的对比影像直观地展示了 Abciximab 注射后，原本阻塞的毛细血管重新被红细胞灌注的过程。动脉血气分析最终证实，Mac-1 抑制剂治疗能显著改善脓毒症小鼠的低氧血症和高碳酸血症，表明肺微循环功能的恢复确实提升了气体交换效率。
研究结论、价值与亮点
本研究的结论是：在脓毒症诱导的急性肺损伤中，上调 Mac-1 的中性粒细胞发生聚集，导致了肺微循环内死腔的形成，而使用 Mac-1 抑制剂能够恢复微循环灌注。这项工作的科学价值在于，它通过自主研发的活体肺成像系统，首次在活体动物中动态揭示了肺微循环死腔形成的细胞机制，颠覆了以往研究由于技术限制而形成的推测性认知。它阐明了一条全新的病理生理通路，即中性粒细胞不仅是通过释放炎症介质间接损伤，更是在早期通过其自身的物理性聚集和阻塞，直接导致了通气-血流比值失调。
其应用价值体现在为治疗脓毒症相关的急性呼吸窘迫综合征提供了“微循环靶向治疗”的新策略和潜在药物靶点。研究亮点尤为突出：一是方法学上的创新，即克服了活体深部肺组织成像的挑战，得以在细胞和亚细胞水平实时观察动态病理过程；二是理论认知上的突破，将中性粒细胞隔离这一早已被发现的现象，与急性呼吸窘迫综合征的核心病理生理改变——“死腔”形成，通过直观的影像证据联系了起来，明确了中性粒细胞作为“堵塞物”的致病角色；三是转化的潜力，研究所用的药物 Abciximab 已获批用于冠脉介入治疗，这使得该成果具备了快速进行临床转化的可能，为临床治疗提供了新思路。