本研究由美国哈佛大学医学院布莱根妇女医院陈氏网络医学部的郭锋、张丽及周晓波等人牵头完成，合作单位包括波士顿大学再生医学中心、匹兹堡大学、克利夫兰诊所、范德堡大学医学中心以及徐州医科大学等。该研究发表于 ebiomedicine（《电子生物医学》）杂志，2024年2月27日在线发表，论文标题为“Identification of a distal enhancer regulating hedgehog interacting protein gene in human lung epithelial cells”（人类肺上皮细胞中调控刺猬相互作用蛋白基因的远端增强子鉴定）。
慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是全球第三大死亡原因。全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）已在染色体4q31区域鉴定出与COPD易感性和肺功能最显著相关的基因间区，而该区域附近的候选因果基因是刺猬相互作用蛋白基因（hedgehog interacting protein，HHIP）。HHIP是刺猬（Hedgehog）信号通路的负调控因子，在肺发育和COPD发病中均发挥重要作用。既往研究发现，HHIP在成年人类肺中主要表达于上皮细胞，而在小鼠肺中则主要在成纤维细胞中表达，但这种物种间细胞类型特异性调控的分子机制尚不清楚。此外，转化生长因子β（transforming growth factor β，TGFβ）在气道重塑和COPD发病中起关键作用，但其与HHIP的调控关系尚未明确。因此，本研究旨在鉴定调控HHIP在人类肺上皮细胞中表达的关键远端调控元件，并探索其在TGFβ信号作用下的调控机制。
研究团队首先利用单核转座酶可及染色质测序（single-nucleus ATAC sequencing，snATAC-seq）技术，分析了人类正常和COPD肺组织中4q31 GWAS区域的开放染色质图谱，以寻找HHIP基因上游可能存在的调控元件。研究对象包括来自健康供者和COPD患者的肺组织单细胞多组学数据，其中snATAC-seq部分纳入了3名COPD患者和健康对照的肺样本。通过比较不同细胞类型的染色质可及性，研究者在HHIP启动子上游约60 kb处发现了一个在人类肺上皮细胞中显著富集的开放染色质区域。
接着，研究团队在人支气管上皮细胞系BEAS-2B中通过染色质免疫共沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）检测了该区域组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化（H3K27ac）的富集情况，并利用报告基因实验验证了该区域两个潜在增强子片段（T2和T4）对HHIP启动子的调控活性。为了进一步确认T2增强子的功能，研究者使用CRISPR/Cas9基因编辑技术在BEAS-2B、原代正常人支气管上皮细胞（NHBE）以及诱导多能干细胞来源的肺泡II型上皮细胞（iAT2）中分别敲除T2区域，随后通过RT-PCR检测HHIP mRNA表达水平的变化。
在确认T2增强子功能的基础上，研究者进一步通过高通量染色质构象捕获技术（Hi-C）和染色体构象捕获（3C）实验，分析了T2增强子与HHIP启动子之间的三维染色质相互作用。为探究T2增强子缺失对局部染色质拓扑结构的影响，他们构建了T2增强子稳定敲除的BEAS-2B细胞系，并比较了野生型与敲除型细胞在全基因组范围内的染色质互作变化。
随后，为阐明TGFβ信号通路对HHIP的调控机制，研究者使用TGFβ1处理BEAS-2B和NHBE细胞，检测不同时间点HHIP表达的变化。他们还利用SAG（Smoothened激动剂）、vismodegib、sonidegib和GANT61等Hedgehog通路激动剂或抑制剂处理细胞，以排除Hedgehog通路的参与。此外，通过ChIP-qPCR检测了Smad3在T2增强子和HHIP启动子区域的结合情况，并使用siRNA干扰Smad2或Smad3表达，进一步评估二者在TGFβ诱导HHIP表达中的作用。
最后，研究者在BEAS-2B细胞中构建了HHIP敲除细胞系，并分别用TGFβ1处理8、16、24和48小时，通过RT-PCR和Western blot检测上皮-间充质转化（epithelial–mesenchymal transition，EMT）相关标志物如CDH2、COL4A1、SNAI1、N-cadherin、Snail和Slug的表达变化，以探究HHIP对TGFβ诱导的EMT的影响。
通过snATAC-seq分析，研究团队发现，在4q31 COPD GWAS区域中，人类肺上皮细胞（包括肺泡II型细胞、基底细胞、俱乐部细胞和纤毛细胞）存在一个显著的开放染色质峰，而该区域在成纤维细胞等其他细胞类型中并不显著。该结果表明HHIP的表达调控元件可能具有肺上皮细胞特异性。
在BEAS-2B细胞中进行的ChIP-qPCR结果显示，T2和T4区域有显著的H3K27ac富集，提示这两个区域可能为活跃增强子。报告基因实验进一步表明，T2和T4片段均能显著增强HHIP启动子的转录活性，且正向和反向插入均有效。值得注意的是，通过UCSC基因组浏览器的保守性分析发现，T2增强子在人类和小鼠基因组之间保守性较差，而HHIP启动子区域则高度保守，这一结果解释了为何HHIP在人类和小鼠中的细胞类型表达模式存在差异。
CRISPR/Cas9介导的T2增强子敲除实验显示，在BEAS-2B、NHBE和iAT2细胞中，T2增强子缺失均导致HHIP表达显著下降，证实了T2增强子在维持HHIP基础表达中的关键作用。Hi-C和3C实验进一步表明，T2增强子与HHIP启动子之间存在稳定的染色质环互作。当T2增强子被敲除后，尽管仅缺失约500 bp的DNA序列，但在4q31区域和HHIP启动子附近的染色质互作频率显著降低，而邻近的其他拓扑关联结构域（topologically associating domains，TADs）则未受明显影响，表明T2增强子对于维持局部染色质三维结构具有特异性作用。
在TGFβ信号通路的调控研究中，研究者发现TGFβ1能够在BEAS-2B和NHBE细胞中时间依赖性地诱导HHIP表达，且这一效应不受Hedgehog通路激动剂或抑制剂的影响，但可被TGFβ I型受体抑制剂SB-431542阻断。ChIP-qPCR结果显示，TGFβ1处理后Smad3在T2增强子区域的结合显著增加。siRNA干扰Smad3而非Smad2能够明显抑制TGFβ1诱导的HHIP表达和T2增强子活性，表明TGFβ通过Smad3依赖的方式激活T2增强子，进而上调HHIP表达。在T2增强子敲除细胞中，TGFβ1诱导的Smad3结合、H3K27ac富集以及HHIP表达均显著降低，进一步证实T2增强子是TGFβ1诱导HHIP所必需的。
在功能研究中，HHIP敲除的BEAS-2B细胞在TGFβ1处理后，其EMT相关基因和蛋白表达水平显著高于对照细胞，表明HHIP缺失可增强TGFβ诱导的上皮-间充质转化。
本研究首次在人类肺上皮细胞中鉴定出一个位于COPD 4q31 GWAS位点内的远端增强子T2，该增强子在维持HHIP基础表达和TGFβ诱导表达中均发挥关键作用。T2增强子通过参与局部染色质拓扑结构维持与HHIP启动子的互作，其功能具有人类特异性，与小鼠同源区域保守性低。TGFβ通过Smad3依赖的方式激活T2增强子，且该调控独立于Hedgehog通路。此外，HHIP可抑制TGFβ诱导的上皮-间充质转化，提示HHIP与TGFβ信号通路之间的复杂交互可能在COPD发病中发挥重要作用。
本研究的科学价值在于揭示了COPD GWAS非编码区域的功能调控元件及其作用机制，为理解HHIP在人类肺上皮细胞中特异性表达的分子基础提供了新见解。同时，该研究也阐明了TGFβ和HHIP之间的调控网络，为后续探索COPD的病理机制和潜在干预靶点奠定了基础。
本研究的亮点主要体现在以下几个方面：一是发现了一个人类特有的远端增强子T2，其功能在多种人类肺上皮细胞模型中得到验证；二是通过Hi-C和3C技术揭示了T2增强子对局部染色质三维结构的维持作用；三是明确了TGFβ以Smad3依赖但Hedgehog非依赖的方式调控HHIP表达；四是发现HHIP缺失可增强TGFβ诱导的EMT，提示HHIP与TGFβ信号通路之间存在功能性对话。此外，本研究也为GWAS非编码区功能研究提供了范例。