CRISPR/Cas13a信号放大联用免疫吸附测定技术实现飞摩尔级蛋白检测的学术研究报告

作者及机构
本研究由Qian Chen（江苏师范大学化学与材料科学学院）、Tian Tian（华南师范大学生命科学学院）、Erhu Xiong（华南师范大学生命科学学院）、Po Wang（江苏师范大学，通讯作者）和Xiaoming Zhou（华南师范大学，通讯作者）合作完成，发表于《Analytical Chemistry》期刊2020年1月刊（Volume 92, Issue 1）。

学术背景
酶联免疫吸附试验（ELISA）是生物医学研究和临床诊断中广泛应用的基础技术，但其检测灵敏度通常局限于皮摩尔（pmol）至纳摩尔（nmol）级别，难以满足癌症、心血管疾病、神经退行性疾病等早期诊断中对超低浓度生物标志物的检测需求。传统ELISA的灵敏度受限于酶标记信号的放大能力，而纳米材料或核酸扩增等改进策略存在生物相容性差、非线性信号放大或操作复杂等问题。CRISPR/Cas13a系统因其RNA引导的RNA反式切割活性（trans-cleavage activity）和高效信号放大能力（单靶标可触发10^4次切割反应），为高灵敏度检测提供了新思路。本研究旨在开发一种基于CRISPR/Cas13a信号放大的新型免疫检测技术（CLISA），将ELISA的检测限提升至飞摩尔（femtomolar, fm）级别。

研究流程与方法
1. CRISPR/Cas13a系统验证
- 实验设计：首先验证Cas13a的RNA反式切割活性。设计带有荧光基团（FAM）和淬灭基团（BHQ）的ssRNA报告探针，当Cas13a/crRNA复合物识别靶标RNA后，激活非特异性切割活性，释放荧光信号。
- 结果：系统可在50 fm的靶标RNA浓度下产生显著信号（图1c-d），且仅当靶标RNA、crRNA和Cas13a三者共存时激活切割（图1b）。

1. 转录辅助的信号放大优化

   • 问题与改进：直接使用生物素化RNA作为信号输出时，因空间位阻和固相反应效率低导致灵敏度不足。研究者引入T7 RNA聚合酶转录步骤，将生物素化双链DNA（含T7启动子）作为模板，转录生成大量RNA以驱动Cas13a信号放大。
     
   • 结果：转录后检测限降至500 amol（图1f-g），较直接RNA检测提升2个数量级。
     

2. 固相CLISA技术开发

   • 流程：
     
     • 抗原捕获：采用夹心法，捕获抗体固定于96孔板，结合目标蛋白（如人IL-6或VEGF）后，加入生物素化检测抗体。
       
     • 信号转换：通过链霉亲和素桥接生物素化DNA模板（含T7启动子），T7聚合酶转录生成RNA。
       
     • Cas13a检测：转录产物激活Cas13a/crRNA切割荧光报告探针，实时监测荧光强度（图3a）。
       
   • 样本与数据：以人IL-6和VEGF为模型，检测范围160 fg/ml至100 pg/ml，线性回归分析显示δτ（荧光信号阈值时间差）与抗原浓度对数呈正相关（图3b-c）。
     

主要结果
- 灵敏度突破：CLISA对人IL-6和VEGF的检测限分别达45.81 fg/ml（2.29 fm）和32.27 fg/ml（0.81 fm），较商业ELISA试剂盒提升264倍和617倍（图3b-c）。
- 特异性与稳定性：RSD（相对标准偏差）低于6.5%（n=8），血清样本回收率83.59%~104.25%（表1），表明方法抗干扰能力强。
- 兼容性：全程37°C等温反应，无需热循环，适配现有ELISA自动化平台。

结论与价值
CLISA通过T7转录与CRISPR/Cas13a双级信号放大，首次将CRISPR系统应用于蛋白检测领域，实现了飞摩尔级灵敏度。其科学价值在于：
1. 方法学创新：将核酸扩增与免疫检测结合，解决了传统ELISA的灵敏度瓶颈。
2. 临床应用潜力：为早期疾病诊断提供超灵敏工具，尤其适用于低丰度生物标志物（如肿瘤相关因子）检测。
3. 技术普适性：可扩展至其他蛋白靶标，且兼容高通量筛选。

研究亮点
- 双级信号放大：T7转录（指数级）与Cas13a反式切割（酶级联）协同提升灵敏度。
- CRISPR技术跨界应用：首次将Cas13a的RNA检测能力转化为蛋白检测信号。
- 操作简便性：等温反应设计避免复杂设备需求，利于临床转化。

局限性与展望
当前CLISA的RNA报告探针易受RNase降解，未来可通过化学修饰（如2′-O-甲氧乙基化）增强稳定性。此外，需进一步验证其在复杂生物样本（如全血）中的性能。

其他价值
研究团队公开了所有实验细节（支持信息），包括DNA模板序列、Cas13a表达质粒来源等，为后续技术优化提供参考。该工作为CRISPR技术在非核酸检测领域的应用开辟了新方向。