本文是一项由Santosha A. Vardhana、Craig B. Thompson等多名研究者合作完成的原创性研究，发表于2020年9月的《自然-免疫学》（*Nature Immunology*）期刊上。主要研究人员来自纪念斯隆-凯特琳癌症中心、帕克癌症免疫治疗研究所、斯坦福大学医学院等机构。
研究背景与目的 本研究处于肿瘤免疫学与细胞代谢的交叉领域。尽管以PD-1抑制剂为代表的免疫检查点阻断（Immune Checkpoint Blockade, ICB）疗法和CAR-T细胞疗法在癌症治疗中取得了显著成效，但多数患者的反应并不持久。一个关键障碍是肿瘤浸润T细胞（Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TILs）在持续的抗原刺激下会进入一种功能耗竭状态（T Cell Exhaustion），其特征是增殖能力丧失、效应功能下降以及抑制性受体（如PD-1、CTLA-4）上调。其中，完全耗竭（Terminally Exhausted）的T细胞彻底失去了自我更新能力，被认为是免疫治疗失败的重要原因。以往研究表明，T细胞活化和功能与其代谢重编程密切相关，但持续性抗原刺激如何通过改变T细胞代谢来损害其自我更新能力，这一机制尚不明确。
本研究旨在探究：1）持续性抗原刺激如何影响T细胞的代谢，特别是线粒体功能；2）这种代谢改变是否以及如何导致了T细胞的增殖障碍和耗竭表型；3）能否通过干预代谢过程来逆转T细胞耗竭，恢复其抗肿瘤功能。
详细研究流程 本研究设计严谨，结合了体外模拟、体内验证、多组学分析和代谢追踪等多种技术手段。
1. 建立体外慢性T细胞刺激模型： 研究人员开发了一套体外系统来模拟T细胞耗竭。使用来自OT-I转基因小鼠的CD8+ T细胞（特异性识别OVA抗原）或多克隆CD8+ T细胞。在初始活化48小时后，将T细胞分为两组：“急性刺激”组在仅含白介素-2（IL-2）的培养基中扩增；“慢性刺激”组则在持续存在特异性抗原（OVA肽段）或包被的抗CD3抗体的条件下扩增，模拟肿瘤微环境中持续的抗原刺激。细胞每两天传代一次，共培养8天或更长时间。通过这一模型，他们成功复制了体内耗竭T细胞的多个特征：丧失产生效应细胞因子（如IFN-γ, TNF）的能力、高表达PD-1等抑制性受体、转录组富集耗竭相关基因、以及体内外抗肿瘤功能丧失。
2. 代谢表型鉴定与机制探索： * 代谢分析： 利用海马（Seahorse）细胞能量代谢分析仪，他们发现慢性刺激的T细胞虽然糖酵解速率（细胞外酸化率，ECAR）很高，但线粒体耗氧率（OCR）随时间推移进行性下降，表明氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation, OXPHOS）受损。这种高糖酵解但低OXPHOS的表型，在患者肿瘤样本的单细胞RNA测序数据中也被证实是终末耗竭T细胞的标志。 * 稳定同位素示踪： 为了深入探究碳代谢流，研究使用了[U-13C]标记的葡萄糖和棕榈酸进行代谢流分析。结果发现，慢性刺激的T细胞虽然能将葡萄糖衍生的乙酰辅酶A送入三羧酸循环（TCA cycle）生成柠檬酸，但下游TCA代谢物（如谷氨酸、苹果酸）的13C标记比例显著降低，表明葡萄糖碳源的完全氧化受阻。棕榈酸的β-氧化同样受损。这提示存在普遍的线粒体氧化功能缺陷。 * 生物能量与合成代谢评估： 液相色谱-质谱联用（LC-MS）代谢组学分析显示，慢性刺激T细胞中所有核苷三磷酸（NTPs，如ATP、GTP）水平均下降，而其对应的核苷单磷酸或核苷水平上升，导致ATP/AMP等比值显著降低。这表明线粒体OXPHOS受损导致的ATP生成不足，限制了核苷二磷酸激酶将核苷单磷酸磷酸化为NTPs的过程，而NTPs是DNA合成和细胞增殖所必需的。有趣的是，脂质合成并未受到限制。
3. 氧化应激的核心作用与机制验证： * 发现氧化应激： 研究发现，慢性刺激T细胞的NADH/NAD+比值升高，但ATP/AMP比值下降，这提示线粒体电子传递链（ETC）与氧化磷酸化解偶联，电子可能泄漏产生活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）。使用荧光探针（如MitoSOX Red, CM-H2DCFDA）直接检测证实，慢性刺激T细胞积累了大量的线粒体和细胞总ROS。 * 因果关系验证： 为了证明线粒体功能障碍和ROS累积足以导致耗竭表型，研究者在急性活化的T细胞中，使用药物直接抑制ETC复合物I（鱼藤酮）或复合物V（寡霉素），或使用氯化钴破坏铁硫簇蛋白。这些处理均成功模拟了慢性刺激的表型：增加ROS、降低ATP/AMP比、抑制增殖、下调自我更新关键转录因子TCF-1、上调耗竭相关转录因子TOX。 * 临床数据关联： 对接受免疫检查点抑制剂治疗的黑色素瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌患者的单细胞RNA-seq数据进行分析，发现终末耗竭T细胞亚群中氧化应激反应基因显著富集，且氧化应激基因表达与TCF7（编码TCF-1蛋白）的表达呈负相关，在体内验证了二者的关联。
4. 抗氧化干预以恢复T细胞功能： * 靶向抗氧化治疗： 基于上述发现，研究者尝试用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine, NAC）干预慢性刺激的T细胞。NAC是合成细胞内主要抗氧化剂谷胱甘肽（Glutathione）的前体。 * 代谢与功能恢复： NAC处理有效降低了慢性刺激T细胞内的ROS水平，恢复了线粒体耗氧率和ATP/AMP比值，并挽救了NTPs的池子。更重要的是，NAC恢复了慢性刺激T细胞的增殖能力。 * 表型与转录重编程： RNA测序和流式细胞术分析表明，NAC处理使慢性刺激T细胞的基因表达谱从终末耗竭向祖细胞样耗竭（Progenitor-like Exhausted）表型转变：TCF-1表达部分恢复，同时仍表达TOX。这类似于体内具有自我更新潜能的耗竭T细胞前体细胞。 * 效应功能增强： 与单纯的免疫检查点阻断（抗PD-L1）不同，NAC处理显著恢复了慢性刺激T细胞产生效应细胞因子（IFN-γ, TNF）和杀伤肿瘤细胞的能力。NAC与抗PD-L1联用显示出协同效应。 * 体内验证： 在B16-OVA黑色素瘤小鼠模型中，将经过NAC处理的慢性刺激OT-I T细胞过继回输，能比未处理组更好地抑制肿瘤生长，延长小鼠生存期，并且肿瘤内T细胞的颗粒酶B表达更高，表明其效应功能增强。此外，在CAR-T细胞和EL4淋巴瘤模型中也证实，NAC能改善体内耗竭T细胞的存活和功能。
主要结果与逻辑关系 本研究的结果环环相扣，形成了一个完整的证据链。首先，通过体外模型建立了持续性抗原刺激与T细胞耗竭表型的直接联系。然后，代谢分析揭示了一个看似矛盾的现象：高糖酵解伴随线粒体OXPHOS受损和ATP生成不足。进一步的代谢流和代谢组学分析将增殖障碍归因于ATP匮乏导致的NTPs合成限制。随后，研究深入到机制层面，发现OXPHOS解偶联导致了ROS的大量积累。通过药理学抑制ETC在正常T细胞中成功“复制”了耗竭表型，证明了氧化应激是“因”而非“果”。最后，基于此机制，使用抗氧化剂NAC进行干预，从代谢、表型、转录和功能多个层面成功逆转了耗竭，并在体内验证了其增强抗肿瘤免疫的潜力。临床样本的生物信息学分析为这一机制提供了人体证据支持。
研究结论与价值 本研究得出核心结论：持续性抗原刺激通过诱导线粒体氧化应激，损害氧化磷酸化，造成细胞生物能量危机（ATP合成不足），从而限制了T细胞的增殖和自我更新能力，并驱动其向终末耗竭表型分化。纠正这种氧化还原失衡（如使用NAC）可以维持T细胞的自我更新程序并增强抗肿瘤免疫。
其科学价值在于： 1. 机制创新： 首次系统阐明了代谢改变（特别是线粒体氧化应激）是连接持续性抗原刺激与T细胞功能耗竭的核心机制，将免疫学与细胞代谢更紧密地联系起来。 2. 概念突破： 挑战了“高糖酵解等于高增殖”的简单认知，揭示了在耗竭T细胞中，高糖酵解可能是一种补偿或副现象，而线粒体功能衰竭才是增殖停滞的根本。 3. 提供新靶点： 指出了线粒体功能和氧化还原平衡是增强T细胞持久力和抗肿瘤功能的新靶标，超越了传统的信号通路（如PD-1/PD-L1）阻断思路。 4. 转化潜力： NAC等抗氧化剂是临床可及的药物，本研究为将其与现有免疫疗法（如免疫检查点阻断、CAR-T）联合使用，以提高疗效和持久性，提供了坚实的临床前理论基础和实验依据。
研究亮点 1. 研究视角新颖： 从代谢角度深入解析T细胞耗竭这一免疫学核心问题，发现了氧化应激这一关键枢纽。 2. 技术体系全面： 整合了经典的免疫学模型、前沿的代谢组学与稳定同位素示踪、单细胞转录组生物信息学分析以及体内外功能验证，多维度论证了假设。 3. 机制验证充分： 不仅观察到相关性，更通过基因操作（过表达NADH氧化酶）和药理学工具（ETC抑制剂）进行了严格的“因-果”关系验证。 4. 临床意义直接： 研究结论源自临床问题（免疫治疗耐药），并通过患者数据验证，最终提出的干预策略（NAC）具有快速向临床转化的可行性。 5. 发现具有普遍性： 机制在多种T细胞类型（转基因T细胞、多克隆T细胞、CAR-T细胞）和多种肿瘤模型（黑色素瘤、淋巴瘤）中得到了验证。