主要作者与研究机构
本研究由 Rebecca Feldman 博士（第一作者及通讯作者）主导，其所属机构为 Caris Life Sciences（位于美国亚利桑那州凤凰城）。其他核心作者包括 Zoran Gatalica 医学博士、Sandeep Reddy 医学博士（同样来自 Caris Life Sciences），以及来自克赖顿大学医学院的 Joseph Knezetic 博士、路易斯安那州立大学 Feist-Weiller 癌症中心的 Cherie-Ann Nathan 医学博士、Hope Health Center 的 Nader Javadi 医学博士和俄亥俄州立大学 Wexner 医学中心的 Theodoros Teknos 医学博士。该研究成果于 2015 年 9 月 13 日被接收，并于 2015 年 11 月 28 日在线发表于 Head & Neck 期刊（DOI: 10.1002/hed.24290），最终收录于该刊 2016 年第 38 卷。
学术背景与研究目的
头颈部鳞状细胞癌（Head and Neck Squamous Cell Carcinoma, HNSCC）是全球范围内年发病例超过 55 万例的恶性肿瘤。其发病主要与烟草、酒精等致癌物暴露以及人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV）感染两大病因有关。临床上，HPV 阳性患者通常预后较好，对治疗的反应也更为理想。然而，HNSCC 的复发率极高，而目前获批的靶向治疗药物极为有限，仅有针对表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）的西妥昔单抗（cetuximab）一种，且其单药客观缓解率仅为 10% 至 13%。更为棘手的是，目前尚缺乏能够可靠预测西妥昔单抗疗效的生物标志物。
在这一背景下，通过分子特征分析来指导治疗选择已被证实能够改善难治性实体瘤患者的临床结局。因此，本研究旨在利用商业化的分子检测数据库，系统性回顾和分析晚期、难治性或转移性 HNSCC 患者中与化疗及靶向治疗敏感性或耐药性相关的生物标志物（即治疗诊断性生物标志物）的分布频率。研究的核心目标是识别传统的和新型的治疗机会，尤其是那些已获批用于其他实体瘤或正处于临床试验阶段的药物靶点，从而为这一难治性患者群体提供超越标准治疗的个体化治疗策略。
详细研究流程与检测方法
本研究是一项基于数据库的回顾性分析，纳入了 2009 年 7 月 30 日至 2015 年 2 月 24 日期间，由 Caris Life Sciences 采用至少一种平台进行前瞻性检测的 735 例晚期 HNSCC 患者样本。其中包含一个已知 HPV 状态的亚组，共 88 例患者（HPV 阳性 39 例，HPV 阴性 49 例）。所有送检样本均为福尔马林固定石蜡包埋组织，并经过病理学家验证以确保肿瘤含量充足和诊断准确。
研究采用多平台分子检测策略，总共检测了 76 种治疗诊断性生物标志物。具体流程包括以下四个主要实验环节：
第一环节：免疫组织化学分析。 该环节利用商业化检测试剂盒和自动化染色平台（包括 Ventana Medical Systems 的 Benchmark XT 和 Dako 的 AutostainerLink 48），对 24 种蛋白质的表达水平进行了检测。检测的蛋白包括 EGFR、MRP1、TOP2A、PD-1、PD-L1、PTEN、TUBB3、ERCC1、RRM1、TS、TOPO1、SPARC、TLE3、HER2、cMET、PGP 等。由经认证的病理学家根据染色强度和阳性肿瘤细胞百分比，采用预先设定的阈值进行人工判读，结果表示为阳性或阴性。例如，EGFR 蛋白过表达的阈值是 ≥1+ 强度和 ≥10% 的肿瘤细胞染色。
第二环节：原位杂交分析。 该环节利用荧光或显色原位杂交技术，分析了 cMET、EGFR、HER2、PIK3CA 和 TOP2A 这 5 个基因的拷贝数变异。通过计算基因信号与对应染色体着丝粒区域信号的比值来判断基因扩增状态。例如，HER2 与 17 号染色体着丝粒的信号比值 ≥2 被判定为扩增。同时，HPV DNA 状态也通过原位杂交技术检测，使用 INFORM HPV III Family 16 探针，能够检测包括 HPV 16、18 在内的 11 种高危亚型。肿瘤细胞核内出现点状杂交信号即为 HPV 阳性。
第三环节：Sanger 测序。 该环节针对 BRAF、cKIT、EGFR、KRAS、NRAS 和 PIK3CA 基因的特定区域进行了测序。利用 M13 连接引物进行聚合酶链反应扩增目标序列，随后使用 BigDye Terminator v1.1 化学法进行双向测序，并在 3730 DNA 分析仪上读取序列。序列痕迹使用 Mutation Surveyor 软件（版本 3.25）进行分析。
第四环节：新一代测序。 该环节利用 Illumina MiSeq 平台，对从肿瘤组织中提取的基因组 DNA 进行测序。使用 Illumina TruSeq Amplicon Cancer Hotspot Panel 对 47 个基因的特定热点区域进行了扩增和测序。所有报告的变异均具有 >99% 的置信度，平均测序深度 >1000×。
数据统计分析采用标准描述性统计方法，并使用 JMP 软件（版本 10.0）进行双尾 Fisher 精确检验以比较亚组间频率差异。采用 Bonferroni 校正以控制多重比较带来的假阳性风险，校正后的 p 值 <0.05 被认为具有统计学显著性。
主要研究结果与逻辑关联
蛋白质表达与基因拷贝数变异结果。 在全部患者群体中，蛋白质过表达频率最高的是 EGFR（90%），其次是 MRP1（89%）、TOP2A（81%）和 PD-1（69%）。值得注意的是，PTEN 蛋白表达缺失的发生率高达 51%。在基因拷贝数层面，PIK3CA 的扩增率最高，达 40%（尽管受检例数仅 5 例），其次为 EGFR，其扩增或多体性发生率为 21%。
这一结果直接指向了几种潜在的治疗策略：EGFR 的高表达支持了西妥昔单抗的应用基础；TOP2A 和 TOPO1（60% 过表达）的高频表达提示拓扑异构酶抑制剂可能有效；而 PTEN 的高频缺失则暗示了 PI3K/AKT/mTOR 通路抑制剂具有广泛的潜在应用价值。此外，MRP1 的高表达（89%）与 PGP 的低表达（仅 3%）这一对比，为化疗药物的选择提供了重要依据。由于紫杉烷类药物是 PGP 的底物而非 MRP1 的底物，这从分子层面支持了在 HNSCC 中优先选择紫杉烷类而非蒽环类化疗药物。
突变分析结果。 在基因突变层面，TP53 是最常发生突变的基因（41%），且在 HPV 阳性亚组中未检测到 TP53 突变，而在 HPV 阴性亚组中突变率高达 57.4%。这一差异具有高度统计学显著性，即便经过 Bonferroni 校正后依然显著。在 TP53 之后，PIK3CA 通路（包括 PIK3CA、PTEN、AKT 和 STK11）是最常发生突变的致癌通路，总突变频率为 19.6%。具体而言，PIK3CA 突变率为 12.59%，PTEN 突变率为 4.01%。其他值得关注的突变包括 BRCA1（5.75%）、BRCA2（9.2%）、FBXW7（4.18%）等。
HPV 状态对生物标志物频率的影响。 对比 HPV 阳性和阴性亚组的分析显示，除 TP53 突变外，其他生物标志物的频率在两组间无显著差异。特别是 PIK3CA 和 PTEN 的突变在两组中均有发生，且 HPV 阳性组中频率略高，这提示 PI3K 通路的异常激活是 HNSCC 中独立于 HPV 状态的普遍事件。
PIK3CA 通路的深入分析。 在 PIK3CA 通路分析中，研究观察到几个关键发现。首先，在 PIK3CA 野生型患者中，有 44% 表现出 PTEN 蛋白表达缺失，这提示即便没有 PIK3CA 突变，PTEN 缺失本身也可能作为预测 PI3K/mTOR 抑制剂疗效的标志物。其次，在 PIK3CA 突变患者中，有 24% 同时存在 PTEN 表达缺失，这可能对 PIK3CA 抑制剂的疗效产生重要影响，因为已有研究提示 PTEN 缺失是 PIK3CA 抑制剂的耐药机制之一。第三，PIK3CA 突变以第 9 外显子突变最为常见（如 E545K 和 E542K），其次是第 20 外显子突变（如 H1047R）。不同位点的突变可能对 PIK3CA 抑制剂的反应不同。第四，PIK3CA 突变很少单独出现，常与其他信号分子异常共存，例如在 53 例 PIK3CA 突变患者中，有 6 例（11%）同时存在 RAS 突变。由于 RAS 突变是西妥昔单抗耐药的重要机制之一，这为联合靶向策略（如西妥昔单抗联合 PI3K/mTOR 抑制剂）提供了理论依据。
PD-1/PD-L1 免疫调节轴的分析。 PD-1 在肿瘤浸润淋巴细胞上的阳性率在 65% 至 72% 之间，在各个疾病分期中均有分布。PD-L1 在肿瘤细胞中的阳性表达在淋巴结转移和区域转移中略高（24%），在远处转移中较低（11%），但差异无统计学意义。在按原发部位分析时，咽部癌的 PD-1 阳性率最高（90%），鼻咽癌的 PD-L1 阳性率最高（28%）。在 HPV 组间比较中，HPV 阳性组的 PD-1 阳性率（66.7%）显著高于 HPV 阴性组（25%），但经过多重比较校正后失去了统计学显著性。这些结果共同表明，PD-1/PD-L1 轴的激活在 HNSCC 中广泛存在，跨越了疾病分期、原发部位和 HPV 状态，提示免疫检查点抑制剂可能对这一疾病具有广泛的应用前景。
病例展示。 研究还提供了一个极具说服力的临床案例：一例 68 岁男性 IV 期下咽鳞癌患者，在经历三种化疗方案和放疗后疾病进展。通过多平台分子分析发现其 PGP 阴性、TS 低表达、TOPO1 阳性、SPARC 和 TLE3 阳性，以及 TP53 致病性突变。基于这些结果，医生设计了包含西妥昔单抗、培美曲塞和白蛋白结合型紫杉醇的联合治疗方案。治疗 2 个月后，PET/CT 显示肿瘤代谢活性近完全消退，达到 90% 至 95% 的治疗反应。尽管患者最终因肿瘤消退后留下的空腔出血导致误吸窒息去世，但这一案例有力地证明了分子特征分析指导下的个体化治疗方案可以带来显著的临床获益。
研究结论与应用价值
本研究通过多平台分子分析，对晚期 HNSCC 的治疗诊断性生物标志物进行了迄今为止规模最大的综合性描述。研究的核心结论是：分子特征分析能够为标准治疗之外提供广泛的治疗选择。具体而言，本研究的数据支持了以下几方面的应用价值：
在化疗药物选择方面，研究明确了 TUBB3、TLE3、PGP 等标志物对紫杉烷类药物的预测价值；TS 低表达对氟尿嘧啶类药物的预测价值；RRM1 低表达对吉西他滨的预测价值；以及 ERCC1 低表达对铂类药物的预测价值。特别地，MRP1 高表达与 PGP 低表达的对比，为在 HNSCC 中优先选择紫杉烷类而非蒽环类药物提供了分子依据。
在靶向治疗机会方面，研究确认了 PIK3CA 通路是 HNSCC 中最具前景的可靶向改变，并强调了利用多平台方法（特别是免疫组化检测 PTEN 蛋白缺失）来更全面地识别可能从 PI3K/mTOR 抑制剂中获益的患者的重要性。同时，研究也鉴定了 HER2 扩增（2.1%）、cMET 过表达（16%）和 EGFR 突变（1%）等低频但具有治疗意义的靶点。
在免疫治疗前景方面，研究证实了 PD-1/PD-L1 免疫检查点轴的激活在 HNSCC 中广泛存在，跨越了病毒性和非病毒性病因，这为免疫检查点抑制剂在这一疾病中的广泛临床应用提供了支持。
研究亮点
本研究的突出亮点包括：第一，首次将大量蛋白质水平的治疗诊断性标志物与基因突变和拷贝数变异数据进行整合分析，提供了 HNSCC 分子全景的系统性描述。第二，通过分析 MRP1 和 PGP 这两个药物转运蛋白的差异表达，为化疗药物的理性选择提供了新的视角。第三，深入分析了 PIK3CA 通路中突变与蛋白表达缺失的共现模式，为未来设计 PI3K 靶向治疗的联合策略和预测耐药提供了重要线索。第四，通过一个详细的临床案例，生动展示了多平台分子分析指导个体化治疗在真实临床环境中的可行性和潜在价值。