学术研究报告：一种基于肽和纳米酶组装的电化学传感器用于灵敏检测淀粉样蛋白-β寡聚体
一、 研究团队与发表信息
本研究的主要作者为 Zhi Li、Pengcheng Ren、Fan Zhang、Junli Cao、Jindong Li、Xiaojie Chai、Jianlong Ji、Shu Qin 和 Qingjiang Wang。他们分别来自中国的三个机构：山西农业大学山西功能农产品检验检测中心、华东师范大学化学与分子工程学院以及太原理工大学集成电路学院。通讯作者为 Zhi Li 和 Jianlong Ji。
该项研究成果以论文形式发表在国际学术期刊 Microchemical Journal 上，论文于2025年5月25日被接收，并于2025年5月27日在线发表，卷期为第214卷，文章编号为114105。
二、 学术背景与研究目的
本研究属于生物传感与纳米医学交叉领域，具体聚焦于阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）早期诊断的生物标志物检测技术。
研究背景：阿尔茨海默病是一种与年龄相关的、进行性的中枢神经系统退行性疾病，全球患者数量巨大且预计将持续增长，给社会带来沉重的经济和护理负担。虽然目前尚无根治方法，但早期诊断和干预治疗有助于延缓疾病恶化。AD的诊断高度依赖于生物标志物的检测，其中淀粉样蛋白-β（Aβ）蛋白的异常聚集是AD核心病理假说——“淀粉样蛋白级联假说”的关键。在Aβ的多种聚集形态（单体Aβm、寡聚体Aβo、纤维Aβf）中，可溶性的Aβ寡聚体（Aβ Oligomer, Aβo）被认为是导致神经毒性和认知功能障碍的关键病理物种，因此是AD早期诊断的理想生物标志物。
目前，Aβo的检测技术包括荧光、表面增强拉曼光谱、质谱和电化学等方法。其中，电化学生物传感器因其检测快速、成本低、样品用量少、可塑性强以及检测限低等优点而备受关注。然而，现有传感器在灵敏度、特异性或稳定性方面仍有提升空间。识别元件（如抗体、适配体、分子印迹聚合物、特定肽序列）和信号放大策略是提升传感器性能的两个关键。肽序列作为识别元件，具有高亲和力、结构稳定、成本效益高和易于合成修饰等优势。在信号放大方面，纳米材料，特别是具有类酶催化活性的纳米酶，展现出巨大潜力。
研究目的：本研究旨在开发一种新型的“三明治”型电化学传感器，以实现对Aβo-42（简称Aβo）的高灵敏度、高选择性检测。其核心创新点在于：1) 结合肽和适配体进行双重识别，以提高捕获的特异性和稳定性；2) 设计并合成一种新型的、具有漆酶（Laccase）模拟活性的纳米酶组装体（CH-Cu-NAs）作为信号放大器，通过其高效的催化能力显著放大检测信号。
三、 详细研究流程
本研究流程系统且严谨，主要包含以下几个关键步骤：
1. 材料合成与制备 * 金纳米颗粒（AuNPs）的合成：采用种子介导的生长法合成梭形金纳米颗粒。首先，在十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）存在下，用硼氢化钠还原氯金酸制备金种子溶液。随后，在含有CTAB、氯金酸、盐酸和硝酸银的溶液中，加入金种子并在60°C下长时间搅拌生长，最终通过离心、洗涤和干燥得到梭形AuNPs，并分散于去离子水中备用。这些AuNPs将作为电极修饰基底，用于固定肽探针。 * 类漆酶纳米酶组装体（CH-Cu-NAs）的制备：这是本研究的核心创新材料。合成分为两步： * CH-Cu纳米酶单体的合成：采用水热法。将半胱氨酸-组氨酸二肽溶液、氯化铜溶液和N,N-二甲基甲酰胺（DMF）混合，置于高压反应釜中在140°C下反应4.5小时。反应产物经离心洗涤和真空干燥后，得到黑色的CH-Cu纳米酶粉末，其具有层状褶皱花状结构。该结构依赖于原料配比和反应温度的设置。 * CH-Cu-NAs的组装与功能化：通过EDC/NHS偶联反应将Aβo的适配体（Aptamer）连接到CH-Cu纳米酶上。随后，引入链霉亲和素（Streptavidin），利用其与适配体上标记的生物素（Biotin）之间的强相互作用，将多个（本研究为四个）CH-Cu纳米酶单体与一个链霉亲和素单元有序组装在一起，形成纳米酶组装体（Apt/CH-Cu-NAs）。这种组装体尺寸达到微米级，但分散性优于单体，且具有更多的催化单元。 * Aβ寡聚体（Aβo）和纤维（Aβf）的制备：为了评估传感器的选择性，研究按照标准协议在体外制备了Aβ的不同形态。将Aβ单体肽粉末溶解在六氟异丙醇（HFIP）中，去除溶剂后，用DMSO重新溶解得到Aβ单体（Aβm）储备液。将Aβm溶液在37°C黑暗中孵育10小时，可形成主要为三聚体、六聚体和14聚体的Aβo；孵育48小时则形成成熟的Aβf。通过圆二色光谱（CD）验证了Aβo的无规卷曲结构。
2. 电化学传感器的构建 传感器的构建在玻碳电极（GCE）上逐层进行，具体步骤如下（如文中Scheme 2所示）： * 电极预处理：将GCE抛光至镜面，并依次在乙醇和去离子水中超声清洗。 * AuNPs修饰：将AuNPs溶液滴涂在清洁的GCE表面，干燥后形成AuNPs/GCE，以增加电极表面积和导电性。 * 肽探针固定：将特定的肽探针（CP）溶液滴加到AuNPs/GCE表面，在4°C黑暗潮湿环境中孵育12小时，通过Au-S键将肽探针固定在金纳米颗粒上，形成CP/AuNPs/GCE。该肽探针用于特异性捕获Aβo。 * 封闭非特异性位点：滴加6-巯基-1-己醇（MCH）溶液，孵育1小时，以封闭电极上未与肽探针结合的金表面，减少非特异性吸附，得到MCH/CP/AuNPs/GCE。 * 目标物捕获：将含有不同浓度Aβo的样品溶液滴加到电极表面，在37°C孵育30分钟，使Aβo被肽探针特异性捕获，形成Aβo/MCH/CP/AuNPs/GCE。 * 信号探针结合：最后，将制备好的Apt/CH-Cu-NAs溶液滴加到电极上，孵育30分钟。Apt/CH-Cu-NAs上的适配体能够特异性识别并结合已被捕获的Aβo，从而形成完整的“肽/目标物/适配体”三明治结构传感器，记为Apt/CH-Cu-NAs/Aβo/MCH/CP/AuNPs/GCE。
3. 电化学测量与性能评估 * 检测原理：完成传感器组装后，将其作为工作电极，与参比电极（饱和甘汞电极，SCE）和对电极（铂丝）构成三电极系统。将电极置于含有50 μM对苯二酚（Hydroquinone，底物I）和50 μM过氧化氢（H₂O₂，底物II）的磷酸盐缓冲液（PBS）中。CH-Cu-NAs具有类漆酶活性，能够催化对苯二酚氧化为苯醌（Benzoquinone）。该氧化反应产生的电流信号（通过差分脉冲伏安法DPV测量）与固定在电极上的Aβo浓度成正比，从而实现对Aβo的定量检测。 * 性能测试： * 可行性验证：通过循环伏安法（CV）和DPV验证传感器构建过程中每一步的电子传递变化和催化活性，确认CH-Cu-NAs的信号放大作用。 * 条件优化：对关键实验条件进行了优化，包括肽探针浓度、Aβo孵育温度以及Apt/CH-Cu-NAs孵育时间，以确定最佳检测条件。 * 信号放大性能比较：通过均相电化学测试，比较了游离的CH-Cu单体和CH-Cu-NAs在相同总纳米酶浓度下的催化电流，证实了组装体的协同催化效应。同时，在传感器平台上比较了使用Apt/CH-Cu和Apt/CH-Cu-NAs作为信号标签时的电流响应，验证了组装体在固相传感界面上的信号放大优势。 * 分析性能评估：测量了传感器对不同浓度Aβo（0.05至5 nM）的DPV响应，绘制标准曲线，计算线性范围、线性方程、相关系数（R²）和检测限（LOD）。 * 选择性与重现性：通过测试传感器对Aβ单体（Aβm）、Aβ寡聚体（Aβo）和Aβ纤维（Aβf）的响应电流，评估其选择性。通过平行制备和测试六个相同的传感器（针对5 nM Aβo），计算相对标准偏差（RSD），评估其重现性。 * 实际样品分析：将不同浓度的Aβo加标到稀释10倍的小鼠血清样本中，用所构建的传感器进行检测，计算回收率，并与商品化的Aβo ELISA试剂盒的检测结果进行对比，评估传感器的实际应用潜力。
4. 材料表征与机理探讨 研究使用了多种技术对合成材料进行了详尽的表征： * 形貌与结构：采用扫描电子显微镜（SEM）和场发射透射电子显微镜（TEM）观察了AuNPs的梭形形貌、CH-Cu的层状褶皱结构以及CH-Cu-NAs的球形堆叠组装结构。 * 元素与价态分析：通过X射线光电子能谱（XPS）分析了CH-Cu-NAs中的元素组成（C, O, N, S, Cu）及铜的价态（Cu⁺和Cu²⁺共存），证实了其作为催化活性中心的可能性。能谱（EDX） mapping显示了各元素在材料中的均匀分布。 * 尺寸与分散性：使用激光衍射粒度分析仪和Zeta电位分析仪测量了CH-Cu和CH-Cu-NAs的粒径分布及多分散指数（PDI），表明CH-Cu-NAs具有更好的分散稳定性。 * 催化机理：基于前人工作和漆酶的催化机制，论文提出了CH-Cu-NAs在对苯二酚-过氧化氢体系中的电催化机理：对苯二酚在Cu-S活性位点被氧化为苯醌并释放质子（H⁺）；电子通过半胱氨酸-组氨酸通路转移；在施加电场下，H₂O₂失去电子生成氧气，氧气再与第一步产生的H⁺结合实现还原；最终，Cu(I)被氧化，活性位点再生。整个过程涉及电催化和组装体介导的纳米催化的级联机制。
四、 主要研究结果
1. 材料成功合成与表征：SEM和TEM图像清晰展示了梭形AuNPs（直径20-50 nm）、层状褶皱花状的CH-Cu纳米酶（直径1.8-3.5 μm）以及由多个CH-Cu单体有序堆叠形成的CH-Cu-NAs组装体。XPS分析证实了Cu⁺/Cu²⁺混合价态的存在，这是其具有氧化还原催化活性的基础。粒径分析表明CH-Cu-NAs的PDI（0.541）低于CH-Cu单体（0.799），说明组装后分散性更佳。CD光谱在196 nm处的负峰证实了成功制备出具有无规卷曲结构的Aβo。
2. 传感器构建可行性得到证实：CV曲线显示，随着肽探针（CP）、封闭剂（MCH）、Aβo以及最终的Apt/CH-Cu-NAs逐层修饰到电极上，[Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻探针的氧化还原峰电流逐渐减小，表明每一步修饰都成功，且绝缘性的生物分子/纳米材料阻碍了电子传递。DPV实验在含有对苯二酚和H₂O₂的体系中进行，结果显示，当修饰了Apt/CH-Cu-NAs后，在0.18 V处出现了显著增强的氧化峰电流，其强度是未修饰CH-Cu-NAs时的5.2倍，这直接证明了CH-Cu-NAs具有优异的类漆酶催化活性，并能有效放大检测信号。
3. 纳米酶组装体展现出卓越的信号放大能力：均相催化实验表明，在相同总纳米酶（按金属含量计）浓度下，游离的CH-Cu-NAs产生的氧化电流信号是游离CH-Cu单体的3.12倍。在固相传感器平台上，使用Apt/CH-Cu-NAs作为信号标签产生的电流响应是使用Apt/CH-Cu单体的2.4倍。这些结果强有力地证明了，通过链霉亲和素-生物素系统将多个CH-Cu纳米酶单体有序组装后，产生了协同催化效应，形成了多维催化界面，优化了电子传递路径，从而显著提升了催化效率，这是实现高灵敏度检测的关键。
4. 传感器表现出优异的分析性能：在优化的实验条件下，传感器对Aβo的检测表现出宽线性范围（0.05 - 5 nM）和极低的检测限（LOD = 0.0192 nM，基于三倍信噪比）。与文献中报道的其他基于电化学的Aβo传感器相比（见表2），该传感器在灵敏度方面具有显著优势。其高性能归因于：1) 肽和适配体的双重识别提高了捕获特异性和效率；2) CH-Cu-NAs作为信号放大器极大地增强了电化学响应。
5. 传感器具有良好的选择性和重现性：选择性实验表明，传感器对目标物Aβo的响应信号（δI ~ 9.2 μA）远高于对相同浓度的Aβ单体（~2.5倍）和Aβ纤维（~4倍）的响应，这得益于肽和适配体对Aβo的特异性双重识别。重现性实验中，六个独立组装的传感器对5 nM Aβo的检测响应相对标准偏差（RSD）仅为3.06%，表明传感器构建过程稳定可靠，这主要归功于肽探针作为识别元件所具有的良好结构稳定性和一致性。
6. 在实际血清样本中取得满意结果：将传感器应用于加标小鼠血清样本中Aβo的检测，在0.1 nM、0.5 nM和1 nM三个加标浓度下，回收率分别为93.0%、103.6%和105.3%，相对误差在±8%以内。同时，将本方法的检测结果与商品化ELISA试剂盒的结果进行对比，两者具有良好的一致性（线性回归方程 y = 0.917x + 0.0213, R² = 0.9993）。这表明该传感器能够有效克服复杂生物基质的干扰，具备用于实际临床样本检测的潜力。
五、 研究结论与价值
本研究成功开发了一种基于肽识别和类漆酶纳米酶组装体信号放大的新型三明治型电化学传感器，用于高灵敏度、高选择性检测阿尔茨海默病的关键生物标志物——淀粉样蛋白-β寡聚体（Aβo）。
科学价值： 1. 提出了创新的信号放大策略：首次将基于半胱氨酸-组氨酸-铜的类漆酶纳米酶组装体（CH-Cu-NAs）作为信号标签应用于生物传感器中。通过有序组装，不仅提高了材料的分散稳定性，更通过形成多活性位点级联催化模式，实现了催化效率的显著提升，为高性能电化学生物传感器的设计提供了新思路。 2. 验证了双重识别模式的优越性：结合了具有刚性结构和稳定性的肽探针以及高亲和力的适配体，构建了“肽/目标物/适配体”双重识别体系。这种设计不仅提高了对Aβo捕获的特异性和牢固性，也增强了传感器的重现性，为复杂生物样品中低丰度标志物的精准检测提供了有效方案。 3. 阐明了纳米酶组装体的催化机理：基于表征和已有知识，提出了CH-Cu-NAS在对苯二酚-过氧化氢体系中的电催化反应路径，深化了对这类仿生纳米材料催化行为的理解。
应用价值： 1. 为AD早期诊断提供了有潜力的工具：该传感器实现了对Aβo的pM级别（0.0192 nM）检测，灵敏度比传统的肽基电化学传感器提高了10倍以上，且在实际血清样本中表现良好，展现了其在阿尔茨海默病早期、无创（血液检测）、低成本筛查和监测方面的应用前景。 2. 为其他疾病标志物检测提供了通用策略：本研究构建的“双重识别元件+纳米酶组装体信号放大”传感平台具有通用性。通过更换识别肽或适配体的序列，该策略可推广至其他蛋白质、核酸或小分子生物标志物的高灵敏检测，在疾病诊断、环境监测和食品安全等领域具有广泛的应用潜力。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
论文还指出，除了在生物传感领域的应用，这种具有独特级联褶皱结构的CH-Cu纳米酶在催化（如污染物降解）和药物负载等领域也显示出巨大的应用潜力。这为纳米酶材料的多元化应用开辟了新的可能性。
该项研究是一项融合了纳米材料合成、生物识别与电化学传感技术的优秀工作，为解决阿尔茨海默病早期诊断的瓶颈问题提供了一种高效、灵敏且具有临床转化潜力的新方法。