研究背景与发表信息

该研究由维也纳大学无机化学研究所的Alexander Rosner、Lukas Skos以及Samuel M. Meier-Menches等人联合完成，合作单位包括维也纳大学分析化学系、维也纳医科大学癌症研究中心及联合代谢组学设施等。研究成果于2025年7月14日发表在期刊 Chemical Science 上，论文标题为“Signalling drives the mode of action of a highly potent N,O,O-tridentate naphthoquinone-based organo-ruthenium anticancer drug candidate”。

学术背景与研究目的

铂类抗癌药物在临床上的成功长期主导了金属药物的DNA靶向范式，但非铂金属药物的作用机制已被证明更为多样，涉及蛋白质靶点和代谢调控。钌基抗癌候选药物是目前最前沿的非铂类治疗药物之一，其中BOLD-100和TLD-1433已进入临床研究阶段。然而，有机金属钌（芳烃）配合物的配体体系对其生物效应具有决定性影响，且其与生物亲核试剂的选择性反应机制仍不完全清楚。此前，该团队报道了一类基于N,O,O-三齿配体的钌（芳烃）配合物，其中化合物1a在化疗耐药的SW480结肠癌细胞系中表现出纳摩尔级的抗增殖活性。本研究旨在阐明该化合物在体外和体内的作用模式，特别关注配体结构对生物活性的影响，以及其与p53信号轴的关系。

研究流程与实验设计

研究首先合成了四种结构相关的N,O,O-三齿金属（芳烃）配合物，包括基于3-乙基萘醌（3-Et-NQ）的钌配合物1a和锇配合物2a，以及基于3-吗啉萘醌（3-Morph-NQ）的钌配合物1b和锇配合物2b。合成采用微波辅助一锅法，以吡唑、萘醌配体和二聚体金属（芳烃）前体为原料，在三乙胺存在下进行。所有配合物通过核磁共振（NMR）、质谱（MS）和元素分析进行表征，确证了三齿配位模式及半缩醛胺碳的存在。

在稳定性与反应性研究中，通过NMR、紫外-可见光谱和电喷雾电离质谱（ESI-MS）考察了化合物在不同浓度下对生物亲核试剂的反应性。在1 mM浓度下，1a在蛋氨酸和半胱氨酸存在时保持稳定；而在40–80 μM的生物学相关浓度下，化合物发生配体交换反应，水解速率呈现金属和配体依赖性。在50 μM浓度下与等摩尔半胱氨酸、蛋氨酸、组氨酸、ATP和GTP混合后，四种化合物均优先与氨基酸形成加合物，未观察到核苷酸金属化。锇配合物的水解动力学慢于钌配合物，符合第三行过渡金属更高的惰性特征。

抗增殖活性测试显示，在SW480细胞中处理24小时后，1a和2a的IC50值分别为0.62±0.04 μM和1.2±0.1 μM，而1b和2b的IC50值分别为38±5 μM和36±7 μM，3-Et-NQ配合物的活性高出30倍以上。这表明配体而非金属中心是决定抗增殖效力的关键因素。

为阐明作用模式，研究采用基于无标记定量（LFQ）的纳流液相色谱串联质谱（nLC-MS/MS）对SW480细胞进行蛋白质组学分析。细胞以各自IC50浓度的化合物处理24小时，设置六个重复，分离细胞质和细胞核组分分别酶解后进行质谱分析。共鉴定5657种蛋白质，采用5%假发现率（FDR）进行多重检验校正。结果显示1a和2a主要影响细胞质蛋白，而1b和2b主要影响细胞核蛋白，表明配体类型决定了整体扰动特征。通过基因本体（GO）细胞组分、生物学过程和KEGG通路富集分析，发现3-Et-NQ配合物显著下调细胞膜、细胞质、线粒体和黏着斑相关蛋白，并影响细胞周期和翻译过程；而3-Morph-NQ配合物上调细胞核、核仁和染色质相关蛋白。所有处理均引起蛋白酶体相关蛋白的上调。

进一步对1a和2a共有的下调蛋白进行STRING网络分析，发现p53（TP53）是细胞周期网络中的核心枢纽，与MAPK3和STAT6相连接。SW480细胞含有双突变的功能获得性p53，而1a处理显著下调细胞质中的p53蛋白水平，2a则无此效应。为验证p53依赖性，研究比较了HCT116 p53野生型（IC50为0.13±0.02 μM）和p53敲除型（IC50为0.26±0.01 μM）细胞系中的活性，证实1a的细胞毒性依赖于p53状态。细胞周期分析显示，1a在12.5–50 nM浓度下剂量依赖性地诱导S期和G2/M期阻滞，与依托泊苷的作用相似。

在机制验证中，免疫荧光染色证实1a处理导致p53信号显著丢失，而非整体蛋白水平下降。蛋白酶体抑制剂硼替佐米可部分恢复p53积累，表明蛋白酶体途径介导了p53降解。p21作为p53下游效应分子，其表达在SW480和CT26细胞中也被1a显著降低。通过肽中心局部稳定性分析（PELSA），研究鉴定DDX3X为1a最可能的直接结合蛋白。DDX3X是ATP依赖性RNA解旋酶，可与p53相互作用并调控p21转录。因此，1a可能通过直接结合DDX3X干扰p53–DDX3X–p21信号轴，导致p21缺失和细胞周期阻滞。

体内实验结果

在CT26结肠癌小鼠异种移植模型中，1a和2a以10 mg/kg剂量腹腔注射两周后显著抑制肿瘤生长，1a在第13天使肿瘤体积减少44%；而1b和2b以30 mg/kg剂量处理时无活性。电感耦合等离子体质谱分析显示，1a主要分布于肝脏（10±1 mg/kg），肿瘤中含量为0.9±0.7 mg/kg，血液中低于0.4 mg/kg。组织学检查显示肝脏形态基本正常。

对1a处理小鼠的肝脏、血浆和肿瘤组织进行蛋白质组学分析。肝脏中鉴定出2770种蛋白质，其中14种显著调控，包括细胞色素P450 3A13（CYP3A13）、血红素加氧酶1（HMOX1）和金属还原酶STEAP4的上调，以及脂质运载蛋白-2（LCN2）、中性粒细胞颗粒蛋白（NGP）和血清淀粉样蛋白P成分（APCS）等急性期反应蛋白的诱导。血浆中鉴定出285种蛋白质，其中79种显著调控，包括CRP、SAA1/SAA2和ORM2等经典急性期标志物的上调，以及补体成分C2、C5、C8和CFD的下调。肿瘤组织中鉴定出3867种蛋白质，其中5种显著调控，包括EGFR的下调。基因集变异分析（GSVA）显示肝脏中“对IL-1的响应”和“白细胞活化”等术语富集，肿瘤中“NF-κB信号调控”降低及“对含砷物质的响应”诱导。EGFR与MAPK3通路及p53信号相关，其下调可能反映1a对p53–DDX3X–p21信号轴的直接作用在体内的体现。

结论与意义

本研究系统阐明了N,O,O-三齿萘醌基金属（芳烃）配合物的作用模式。与含双齿配体的其他金属（芳烃）化合物不同，该家族化合物具有较长时间的动力学惰性，但保留通过金属–氧键水解的活化能力。配体结构对抗增殖活性、蛋白质组扰动特征及体内肿瘤抑制效果具有决定性影响，金属中心的影响相对次要。3-Et-NQ配合物通过下调p53并干扰p53–DDX3X–p21信号轴发挥抗肿瘤作用，且对携带突变p53的肿瘤细胞具有更高敏感性。化合物1a在体内通过直接效应（EGFR下调）和系统性应激反应（急性期蛋白诱导）共同实现肿瘤抑制。该研究提供了一种结合体外蛋白质组学解析和体内组织蛋白质组学验证的策略，可用于阐明表型筛选发现的金属类抗癌药物的作用机制。p53突变状态作为1a敏感性的潜在生物标志物值得进一步研究，为钌基抗癌药物的精准治疗提供了新方向。

研究亮点

本研究的主要发现包括：首次证实N,O,O-三齿萘醌基金属（芳烃）配合物通过p53–DDX3X–p21信号轴发挥作用；揭示DDX3X为1a的直接结合靶点；证明配体结构而非金属中心决定生物活性；在体内模型中验证了基于蛋白质组学的作用模式推断。方法学上，PELSA技术用于金属药物直接靶点鉴定具有新颖性，亚细胞分辨率蛋白质组学结合体内组织分析为药物作用模式研究提供了完整范式。