线粒体功能障碍通过铁硫簇缺陷导致核基因组不稳定

本研究由Joshua R. Veatch、Michael A. McMurray、Zara W. Nelson和Daniel E. Gottschling等人完成，其中Joshua R. Veatch和Michael A. McMurray来自Fred Hutchinson癌症研究中心基础科学部和华盛顿大学分子与细胞生物学项目，Zara W. Nelson来自Fred Hutchinson癌症研究中心基础科学部，通讯作者Daniel E. Gottschling同样来自Fred Hutchinson癌症研究中心基础科学部。该研究于2009年6月26日发表在《Cell》杂志第137卷第1247至1258页，数字对象标识符（DOI）为10.1016/j.cell.2009.04.014。

本研究的学术背景涉及线粒体功能、核基因组稳定性以及铁硫簇生物合成等多个领域的交叉。线粒体DNA（mtDNA）的突变和缺失以及核基因组的不稳定性涉及多种人类疾病，核基因组不稳定是癌症的一个标志性特征，而杂合性丢失（loss of heterozygosity, LOH）是肿瘤进展中基因组不稳定的一种重要形式。在酵母中，线粒体功能缺陷与核基因组遗传改变水平的增加有关，但线粒体功能与核基因组完整性之间的具体联系机制尚不清楚。线粒体除了通过氧化磷酸化产生细胞能量外，还参与铁代谢、程序性细胞死亡、活性氧产生以及中间代谢等保守过程。铁硫簇（iron-sulfur cluster, ISC）的合成是线粒体的一项基本功能，铁硫簇在多种细胞蛋白中起催化和结构作用。铁硫簇的组装起始于线粒体基质，随后被整合到线粒体含铁硫簇蛋白中，或被导出线粒体用于胞质和核内含铁硫簇蛋白的组装。因此，所有含铁硫簇蛋白的组装都需要完整的线粒体。本研究旨在阐明线粒体功能障碍如何导致核基因组不稳定，并揭示二者之间的分子机制。

研究的工作流程可分为多个层次。首先，研究者通过谱系分析（pedigree analysis）对单个酵母母细胞产生的子细胞集落进行观察，发现在母细胞经历约25次分裂后，LOH事件显著增加，且这些LOH事件与线粒体功能障碍相关。为了确定线粒体功能障碍与LOH之间的因果关系，研究者采用两种独立方法消除mtDNA：一是构建显性负性突变等位基因mip1dn，在雌二醇诱导下表达6至7小时即可导致mtDNA快速完全丢失；二是使用低剂量溴化乙锭（ethidium bromide）瞬时处理细胞以优先消除mtDNA。两种方法处理后的细胞均表现出染色体XII和IV位点上LOH频率的大幅升高，且LOH事件源于重组而非染色体丢失或位点特异性突变。进一步观察发现，mtDNA丢失后细胞经历一个被研究者定义为“细胞危机”（cellular crisis）的过程，表现为进行性生长减缓、细胞周期G1期阻滞以及核基因组不稳定。为了区分这种危机是呼吸缺陷的一般后果还是mtDNA丢失的特有效应，研究者构建了三个核基因缺失突变株：cat5Δ（辅酶Q合成缺陷）、rip1Δ（电子传递链复合体III组分缺陷）和cox4Δ（电子传递链复合体IV功能缺陷）。这三个突变株均完全丧失呼吸能力，但生长速率正常且LOH频率不增加；然而在消除mtDNA后，它们与野生型一样经历危机。这表明呼吸缺陷本身不足以引起危机和LOH的增加，mtDNA丢失还产生了超越呼吸功能丧失的其他效应。研究者推测线粒体内膜电化学势（Δψ）的降低可能参与了危机的发生。为验证这一假设，研究者使用atp1-111等位基因，该等位基因编码过度活跃的F1 ATP合酶，能在ρ0细胞中产生比野生型更高的Δψ。结果显示atp1-111/atp1-111二倍体细胞在mtDNA丢失后未出现明显的危机，生长稳健，细胞周期阻滞消失，核LOH显著降低。研究者还通过荧光蛋白定位实验进一步提供了Δψ重要性的证据：使用预序列偶联的mCherry（preCox4-mCherry）作为线粒体基质靶向蛋白导入的报告分子，以及Tom70-GFP作为线粒体外膜蛋白的标记。在mtDNA完整的细胞中，preCox4-mCherry与Tom70-GFP共定位于网状结构；而在ρ0细胞中，preCox4-mCherry呈现弥散的胞质定位，表明基质蛋白导入受损。atp1-111突变使ρ0细胞中preCox4-mCherry线粒体定位的细胞比例从12%显著增加到67%。这些数据表明mtDNA丢失后Δψ降低，Δψ降低导致细胞危机和核基因组不稳定的增加。

为了从独立角度理解线粒体功能障碍与LOH的关系，研究者进行了表达谱分析。mtDNA丢失27小时后，313个基因上调，174个基因下调超过2倍。最显著变化的基因组与铁饥饿的转录特征高度匹配：上调基因富集于Aft1和Aft2转录因子在铁饥饿条件下诱导的铁吸收相关基因（18个中有16个，p=7.1×10⁻¹⁹），下调基因富集于铁饥饿期间mRNA被降解的铁依赖性基因（34个中有16个，p=4.63×10⁻¹⁶）。铁饥饿响应在mtDNA丢失后3小时即有轻微诱导，但大多数基因的最大诱导发生在24小时后。酵母的铁感应由环境铁的获取、线粒体中铁硫簇的成功包装以及铁硫簇从线粒体向胞质的导出共同介导。胞质铁硫簇作为信号使铁调节子转录因子Aft1和Aft2定位于胞质。因此，铁可用性或输入缺陷、线粒体铁硫簇生物合成或线粒体铁硫簇导出缺陷，或Aft1/Aft2定位异常都可能导致铁饥饿响应。研究者提出mtDNA丢失后的铁饥饿响应的原因是线粒体铁输入、铁硫簇生物合成或铁硫簇导出缺陷。这一结论基于以下观察：第一，mtDNA丢失增加了总细胞铁含量，表明铁可用性和输入不是响应的原因；第二，mtDNA丢失27小时后的表达谱与线粒体铁硫簇生物合成关键蛋白Yah1耗尽的细胞以及线粒体铁硫簇导出蛋白Atm1耗尽的细胞的表达谱高度相似（Yah1耗尽上调基因重叠p=7.6×10⁻⁸²，下调基因重叠p=1.3×10⁻⁴³；Atm1耗尽上调基因重叠p=1.9×10⁻³¹，下调基因重叠p=3.0×10⁻²⁵）；第三，atp1-111/atp1-111突变在mtDNA丢失后极大地抑制了铁调节子的激活；第四，已有文献报道在缺乏mtDNA的细胞和缺乏线粒体膜电位的细胞中线粒体铁硫簇生物合成受损。这些观察表明mtDNA丢失导致线粒体铁代谢缺陷，这可能参与危机的发生和核基因组不稳定。

铁硫簇生物合成受损有两个主要后果：一是铁调节子激活导致细胞游离铁水平升高，二是胞内各区域含铁硫簇蛋白功能降低或丧失。升高的游离铁可导致细胞周期异常和生物分子（包括蛋白质和DNA）氧化损伤。研究者检测到mtDNA丢失后细胞铁含量增加和蛋白质氧化损伤增加。为确定铁含量升高和氧化损伤是否导致危机和LOH，研究者删除了AFT1基因（铁调节子的主要激活因子）。aft1Δ细胞在mtDNA丢失后未经历细胞铁含量增加和蛋白质氧化增加，但核LOH增加和生长减缓仍然存在，尽管动力学较野生型减慢。这表明铁含量增加和氧化损伤可能参与危机但不为核基因组不稳定所必需。因此，mtDNA丢失后的核基因组不稳定可能是含铁硫簇蛋白功能降低的直接后果，而非铁调节子激活的间接后果。

为验证非线粒体含铁硫簇蛋白功能降低是否直接导致核基因组不稳定，研究者构建了可调控NAR1基因表达的等位基因。NAR1的抑制仅改变非线粒体蛋白的铁硫簇包装，不诱导铁调节子，也不改变线粒体蛋白的铁硫簇插入。在低雌二醇条件下（NAR1受抑制），细胞表现出进行性生长减缓但无G1期阻滞，菌落中染色体XII和IV位点LOH频率显著增加，且铁调节子未被激活。这一结果直接证明非线粒体含铁硫簇蛋白功能的降低足以导致核基因组不稳定，并提示这些蛋白功能的丧失或降低在mtDNA丢失后的危机中发挥作用。危机的其他方面如G1特异性阻滞可能由mtDNA丢失影响的其他未知过程介导。

研究的主要结论是：线粒体功能障碍通过抑制含铁硫簇蛋白的产生来刺激核基因组不稳定，这些含铁硫簇蛋白为维持核基因组完整性所必需。具体而言，mtDNA丢失或损伤导致线粒体膜电位降低，进而损害线粒体蛋白导入，导致线粒体铁硫簇生物合成或导出缺陷。这引起铁调节子激活和含铁硫簇蛋白功能的降低，其中含铁硫簇蛋白功能的降低直接导致核基因组不稳定。研究者提出了一个分子级联模型：正常细胞中铁在线粒体中包装成铁硫簇，部分铁硫簇被导出到胞质，抑制铁调节子诱导并维持核基因组完整性相关蛋白的功能；mtDNA丢失后，Δψ降低损害线粒体铁硫簇生物合成或导出，导致铁调节子诱导和核基因组不稳定；人为降低NAR1功能则在不影响线粒体功能和铁调节子的情况下直接导致核基因组不稳定。酵母基因组中含铁硫簇的核基因组完整性蛋白包括Rad3（核苷酸切除修复解旋酶）、Pri2（滞后链DNA合成引物酶，重要于DNA双链断裂修复）和Ntg2（碱基切除修复糖基化酶），这些蛋白活性的同时减弱可能解释了观察到的基因组不稳定性的高发生率。

本研究的重要意义在于揭示了线粒体功能与核基因组稳定性之间的直接分子联系，将焦点从线粒体的呼吸功能转向了其非呼吸功能——铁硫簇生物合成。这一发现对理解人类疾病具有重要意义：人类细胞在mtDNA丢失后线粒体膜电位同样降低，线粒体在铁硫簇生物合成中的基本作用以及含铁硫簇蛋白在核基因组稳定性中的作用都是保守的。因此，研究推测线粒体的非呼吸功能，包括铁硫簇生物合成，可能在mtDNA损伤导致的人类疾病中发挥作用。此外，研究者提出了一个“高突变状态”的概念：度过危机的细胞可能经历了超突变状态，类似于细菌和真核细胞在应激条件下的表现，基因改变的幸存者在危机后恢复到相对正常的基因组不稳定水平。

本研究的亮点包括：首次将谱系分析中观察到的年龄相关LOH与mtDNA损失直接联系起来，将年龄相关LOH现象分为mtDNA功能丧失和随后的危机两个步骤；发现了“细胞危机”这一新现象，表现为进行性生长减缓、G1期阻滞和核基因组不稳定，并伴随对核突变的筛选；证明呼吸缺陷本身不足以引起危机，关键在于Δψ的降低和线粒体蛋白导入的受损；通过表达谱分析发现mtDNA丢失诱导铁饥饿转录特征，并通过NAR1调控实验直接证明非线粒体铁硫簇蛋白功能降低足以导致核基因组不稳定；鉴定了自发核抑制突变可以改善ρ0细胞的生长，提示细胞在危机中通过遗传改变进行适应。本研究还从历史角度解释了早期关于“核外呼吸突变”的观察，为理解线粒体功能障碍与核基因组不稳定之间的关系提供了统一框架。