该研究由来自中国宜宾市第二中医医院康复科的张富多、杨应秋（共同第一作者）及通讯作者何怀云等人完成，并于2026年发表在 Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology 期刊上。此研究是一项针对椎间盘退变（Intervertebral Disc Degeneration, IVDD）分子机制和潜在治疗化合物的原创性研究。
椎间盘退变（IVDD）是导致下腰痛的主要病理基础，随着全球人口老龄化，下腰痛已成为一个严峻的公共卫生问题。据预测，到2050年，全球下腰痛患者将超过8亿人。IVDD的发生涉及髓核（Nucleus Pulposus, NP）细胞在氧化应激、炎症因子、异常机械负荷等多种病理刺激下功能失调，导致细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）合成与降解失衡，进而引发椎间盘结构崩解。然而，其背后的关键分子机制仍不完全清楚。近年来，炎症和免疫微环境的重塑被认为在IVDD中扮演重要角色。同时，高通量测序和计算生物学的进步为识别疾病关键基因和通路提供了有力工具。特别是单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，能够高分辨率地揭示NP细胞的异质性及其在退变过程中的动态变化。槲皮素（Quercetin）作为一种广泛存在于植物中的黄酮类化合物，在多种退行性疾病模型中显示出抗炎、抗氧化、抗衰老和基质保护等多重生物学活性，但其在IVDD中的潜在分子靶点尚待明确。因此，本研究旨在通过整合生物信息学、单细胞分析及实验验证，系统性地鉴定与IVDD相关的核心枢纽基因（Hub Genes），并探索槲皮素对NP细胞的潜在保护作用。
本研究采用了多步骤、多层次的整合策略，具体流程如下：
1. 数据获取与差异表达基因（DEGs）筛选 研究团队从公共基因表达数据库（GEO）获取了IVDD相关转录组数据集GSE70362。为聚焦于NP细胞功能障碍，他们仅选取了该数据集中24个髓核样本进行分析，其中包括16个IVDD样本和8个对照样本。利用R语言的limma包进行差异表达分析（Differential Expression Analysis），以|log2倍变化| > 0.5且名义P值 < 0.05为初步筛选标准，共鉴定出352个差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs），其中包含142个上调基因和210个下调基因。
2. 加权基因共表达网络分析（WGCNA）与候选基因筛选 为识别与IVDD疾病状态高度相关的基因模块，研究者对同一表达矩阵进行了WGCNA（Weighted Gene Co-expression Network Analysis）分析。在选取合适的软阈值（Power = 16）构建无尺度网络后，通过动态剪切树算法识别出多个共表达模块。结合模块-性状相关性分析，确定了5个与IVDD最显著相关的模块（如lightcyan、steelblue等），共包含454个基因。随后，将这454个WGCNA模块基因与前述352个DEGs取交集，得到154个重叠基因，作为进一步分析的核心基因集。
3. 枢纽基因（Hub Genes）的鉴定 针对154个重叠基因，研究者首先利用STRING数据库构建了蛋白质-蛋白质互作（PPI）网络，并通过Cytoscape软件中的Cytohubba插件的“Degree”算法，筛选出网络中连通性最强的30个候选核心基因。为了进一步精简模型并避免过拟合，他们采用了LASSO回归（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator）分析，最终鉴定出5个关键的枢纽基因：ZEB2, COL6A2, CCND1, RAP1A, 和 GATA3。
4. 功能富集与作用机制探索 为探究这些基因的生物学意义，研究团队首先对重叠基因组进行了基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。随后，对每个枢纽基因分别进行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA），以揭示其相关的信号通路。
5. 免疫浸润与单细胞分析 通过单样本基因集富集分析（ssGSEA）算法，研究者基于转录组数据估算了对照与IVDD样本中免疫细胞的相对丰度。为进一步在细胞层面验证结果，他们分析了来自GEO数据库的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集GSE230809。使用Seurat包和Harmony算法对数据进行质控、标准化、降维、批次校正和聚类，并根据标记基因对NP细胞亚群进行注释。此外，还利用CellChat工具进行了细胞间通讯分析。
6. 候选化合物筛选与分子对接（Molecular Docking） 基于枢纽基因网络，槲皮素（Quercetin）被选为候选治疗化合物。研究者利用AutoDock Vina软件，将槲皮素与由AlphaFold数据库预测的五个枢纽蛋白（CCND1, COL6A2, GATA3, RAP1A, ZEB2）的蛋白结构进行分子对接，以预测其结合亲和力和结合模式。
7. 体外实验验证 为验证生物信息学预测，研究使用永生化人髓核细胞进行体外（*in vitro*）实验。使用脂多糖（LPS）刺激NP细胞，建立炎症退变样细胞模型。通过CCK-8（Cell Counting Kit-8）实验筛选槲皮素的安全有效浓度（40 μM）和干预时间（24小时）。实验分为对照组、LPS模型组和LPS+槲皮素治疗组。通过蛋白质印迹法（Western Blotting）和实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测5个枢纽基因在蛋白质和mRNA水平的表达变化，并使用活/死细胞染色评估细胞存活状态。
1. 枢纽基因的鉴定与表达验证 差异分析和WGCNA成功鉴定出5个核心枢纽基因。在IVDD组织中，GATA3, CCND1, RAP1A, 和 ZEB2 的mRNA水平显著上调，而COL6A2则显著下调。这个结果通过LASSO回归得到确认，形成了一个与IVDD紧密相关的分子标签。
2. 功能富集与通路分析结果 GO和KEGG分析表明，这些IVDD相关基因主要富集于细胞应激反应、细胞外基质（ECM）重塑、细胞衰老、p53信号通路、局部粘着斑以及Rap1信号通路等。GSEA进一步揭示了每个枢纽基因的功能倾向：CCND1高表达与免疫和炎症通路激活相关；RAP1A与MAPK和TGF-β信号相关；COL6A2低表达与ECM-受体互作及糖胺聚糖降解等通路相关。这些结果描绘了IVDD多通路协同失调的复杂图景。
3. 免疫微环境重塑 免疫浸润分析显示，与对照组相比，IVDD样本中免疫细胞组成发生显著改变。调节性T细胞1型和2型（Tr1和Th2）细胞浸润减少，而巨噬细胞浸润显著增加。这表明IVDD进展伴随着局部免疫微环境从稳态向促炎状态的转变。
4. 单细胞层面的异质性证据 scRNA-seq分析将髓核细胞分为7个不同功能状态的亚群，包括基质稳态型、纤维化型、炎症型、增殖型、应激反应型和SPP1+退变型等NP细胞。特征图显示，枢纽基因在不同细胞亚群中呈现异质性分布，例如CCND1主要富集在增殖活性特征的细胞群中，而COL6A2则分布广泛。细胞通讯分析进一步揭示，IVDD组中，不同NP细胞亚群间的相互作用网络发生了显著重塑，提示退变是一个涉及多细胞状态协调变化的组织层面过程。
5. 槲皮素的分子对接与保护效果 分子对接预测显示，槲皮素与五个枢纽蛋白均具有较好的潜在结合亲和力（结合能范围为-6.6至-9.2 kcal/mol）。体外实验证实了这一趋势：与LPS模型组相比，槲皮素（40 μM）处理能显著提高NP细胞活力，逆转LPS诱导的ZEB2, RAP1A, GATA3, 和 CCND1的表达上调，并部分恢复COL6A2的表达。活/死细胞染色也直观地证实槲皮素可减轻LPS造成的细胞损伤。
本研究成功鉴定并验证了ZEB2, COL6A2, CCND1, RAP1A, 和 GATA3 这五个基因可作为IVDD进展中具有潜在调控作用的核心枢纽基因。研究论证了IVDD的发病机制并非单一分子事件，而是涉及细胞衰老、ECM重塑、炎症反应和免疫微环境改变的复杂过程。在此理论基础上，研究发现天然化合物槲皮素能够通过调节上述多个靶点的表达，有效减轻LPS诱导的髓核细胞损伤。这为槲皮素作为IVDD治疗候选药物提供了多层面的分子依据，也为将来开发针对椎间盘退变的多靶点治疗策略提供了新的线索和方向。