关于《Neoantigen-specific stimulation of tumor-infiltrating lymphocytes enables effective TCR isolation and expansion while preserving stem-like memory phenotypes》研究的学术报告

本文旨在向国内研究同仁详细介绍一项发表在《Journal for Immunotherapy of Cancer》上的重要研究。该工作由美国国立癌症研究所（National Cancer Institute）手术分支中心（Surgery Branch, Center for Cancer Research）的Steven A. Rosenberg团队主导，主要作者包括Noam Levin和Sanghyun P. Kim等，于2024年发表。本研究聚焦于肿瘤免疫治疗领域，特别是针对实体瘤的过继性细胞疗法（Adoptive Cell Therapy， ACT）。研究的核心背景在于，尽管靶向新抗原（neoantigen）的肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-Infiltrating Lymphocytes， TILs）能够有效治疗部分转移性实体瘤，但在临床上广泛运用仍面临两大挑战：首先，新抗原反应性T细胞在TILs中通常非常稀少且处于耗竭（exhausted）状态；其次，传统的体外扩增方法（如使用OKT3抗体进行的快速扩增， Rapid Expansion Protocol， REP）缺乏抗原特异性，会导致旁观者（bystander）T细胞过度生长，从而进一步稀释了本就稀少的新抗原反应性T细胞群体，并可能加剧其耗竭表型，这给后续分离有效的新抗原反应性T细胞受体（T-Cell Receptor， TCR）以及制备用于患者治疗的高反应性TIL产品带来了巨大困难。因此，本研究的目标是开发一种能够在体外选择性扩增新抗原反应性TILs的方法，以期更高效地分离新抗原反应性TCR，并制备出具有更佳表型和功能的TIL产品，最终提升过继性细胞治疗的临床疗效。

本研究的详细工作流程系统而严谨，可分为多个关键环节。研究对象为25例连续入组的、其肿瘤携带p53或RAS家族（KRAS， NRAS， HRAS）突变的转移性上皮癌患者的TILs样本。这些突变被选作研究模型，因为它们是人类癌症中普遍存在的新抗原。研究的核心是开发并验证一种名为“NeoExpand”的体外TIL培养新方法。该方法的核心思想是提供新抗原特异性刺激，以选择性扩增目标T细胞。具体流程如下：首先，研究团队从患者肿瘤组织建立TIL片段培养物或使用新鲜肿瘤消化物作为起始材料。其次，制备抗原呈递细胞（Antigen-Presenting Cells， APCs），包括自体树突状细胞（Dendritic Cells， DCs）、B细胞，或经过HLA（人类白细胞抗原）工程化改造的细胞系（如COS7细胞）。第三，将新抗原装载到APCs上。装载抗原的方式多样，体现了方法的灵活性：可以通过电转或脂质体法将编码突变抗原的串联小基因（Tandem Minigene， TMG）RNA瞬时转入APCs；也可以通过病毒载体使APCs稳定表达TMG；还可以直接使用含有突变位点的长肽段（24-25个氨基酸）或预测的最小表位肽脉冲APCs。对于私有新抗原，研究团队会基于肿瘤全外显子组测序结果，利用NetMHCpan、MHCflurry等算法及自有机器学习模型预测并优先选择少数几个（少于10个）候选最小表位。随后，将TILs与这些装载了新抗原的APCs共同培养，培养基中添加白细胞介素-2（IL-2）和白细胞介素-21（IL-21）。IL-21的加入是基于前期研究，它能在IL-2诱导分化的同时，帮助维持抗原经验性T细胞的增殖能力。整个NeoExpand过程大约需要2周时间。

为了全面评估NeoExpand的效果，研究设计了一系列对比实验和分析。一方面，将NeoExpand与传统的OKT3快速扩增法在扩增效率、细胞表型和功能上进行直接比较。扩增效率通过计算总CD3+ T细胞和新抗原反应性T细胞的倍数增长来评估。新抗原反应性T细胞的频率通过多种方法确定：包括与抗原负载APCs共培养后，通过流式细胞术检测激活标记物4-1BB和OX-40的上调；使用新抗原特异性HLA四聚体进行染色；以及通过干扰素-γ（IFN-γ）酶联免疫斑点（ELISpot）检测。另一方面，为了深入理解不同扩增方法对T细胞状态的影响，研究团队对经过不同方式处理的TIL样本（如未经刺激的Pre-TIL、经NeoExpand扩增的TIL、经传统REP扩增的TIL）进行了高精度的单细胞RNA测序（Single-cell RNA sequencing， scRNA-seq）分析。这有助于在转录组水平描绘不同T细胞亚群的表型特征，特别是新抗原反应性T细胞的表型变化。此外，研究还包含TCR的分离与功能验证环节。从经NeoExpand富集的新抗原反应性T细胞中，通过流式分选激活的（4-1BB+/OX-40+）CD4+或CD8+ T细胞，然后进行TCR测序以获得其互补决定区3（CDR3）序列。将获得的TCR序列构建到逆转录病毒载体中，转导健康供者的外周血淋巴细胞（Peripheral Blood Lymphocytes， PBLs），以验证TCR对新抗原的特异性（通过肽段滴定、HLA限制性分析）和功能。最后，也是最关键的功能验证环节，是在体内动物模型中进行疗效评估。研究建立了多种人源肿瘤异种移植（Xenograft）小鼠模型，例如使用天然表达p53 R175H突变和HLA-A*02:01的卵巢癌细胞TYK-NU，或使用表达KRAS G12V突变和HLA-C*01:02的患者来源异种移植（Patient-Derived Xenograft， PDX）肿瘤细胞。在小鼠肿瘤建立后，分别过继输注经NeoExpand或传统REP扩增的TILs，或输注转导了从NeoExpand中分离出的新TCR的工程化PBLs，持续监测肿瘤生长情况，以比较不同治疗组的抗肿瘤效果。

本研究取得了一系列重要且相互印证的成果。首先，研究证实了传统REP方法的局限性。通过对10例已用于临床试验的乳腺癌TIL输注产品进行分析发现，与快速扩增前的片段培养物相比，所有10种新抗原反应性在输注产品中的频率均下降，部分甚至下降了超过10倍，变得几乎无法检测。这直接说明了非特异性扩增会稀释新抗原反应性T细胞。其次，研究成功证明了NeoExpand方法的有效性。在25例连续患者的TIL样本中，传统扩增和筛选仅鉴定出9种针对p53或RAS突变的新抗原反应性，而NeoExpand则成功鉴定出16种反应性，涵盖了传统方法发现的所有9种，并且新发现了7种。从克隆型水平看，传统方法鉴定出14个克隆型（3个CD4+， 11个CD8+），而NeoExpand鉴定出多达42个克隆型（14个CD4+， 28个CD8+）。这清晰地表明，NeoExpand不仅能提高新抗原反应性T细胞的频率，更重要的是能拓宽其克隆多样性，使得那些原本稀少、在传统培养中被淹没的克隆得以扩增并被发现。研究提供了多个具体案例，例如从结直肠癌患者4，141的TILs中，NeoExpand成功扩增了p53 R175H反应性T细胞，并分离出一个新的高特异性TCR，该克隆在患者的传统TIL输注产品中频率低于0.01%。同样，在乳腺癌患者4，386中，NeoExpand成功恢复了在传统REP后几乎消失的CD4+ p53 R273C反应性T细胞克隆，并分离出其TCR。

第三，在扩增效率的直接对比中，虽然传统REP在总CD3+ T细胞的扩增倍数上通常高于NeoExpand，但NeoExpand在新抗原反应性T细胞的扩增倍数上显著优于REP。对11例TIL样本的汇总分析显示，NeoExpand在新抗原反应性T细胞扩增倍数上具有统计学显著优势。第四，单细胞转录组分析揭示了表型差异的深层机制。分析显示，经NeoExpand扩增的新抗原反应性T细胞更多地富集在具有干细胞样记忆（stem-like memory）表型的细胞簇中。这些细胞高表达与干细胞样记忆和长期存活相关的基因，如IL7R（CD127）、SELL（CD62L）、KLF2和TCF7（TCF1），而低表达耗竭相关标志物如CD39、HAVCR2（TIM3）。相比之下，经传统REP扩增后，具有这种有利表型的新抗原反应性T细胞比例大幅减少。这表明NeoExpand不仅能选择性扩增目标细胞，还能帮助其维持一种更“年轻”、更具增殖潜力和持久性的表型。第五，体内功能实验提供了最有力的证据。在三个独立的异种移植小鼠模型中（分别针对p53 R175H和KRAS G12V/G12D新抗原），输注经NeoExpand扩增的TILs均表现出显著优于传统REP扩增TILs的抗肿瘤效果，能引起肿瘤显著消退或生长延迟。而从NeoExpand中分离出的新TCR，在转导至PBLs后，也在相应的小鼠模型中证实了其特异性杀伤肿瘤的能力。

基于以上结果，本研究得出明确结论：通过NeoExpand方法进行的新抗原特异性刺激，能够克服传统TIL扩增方法的缺陷。它可以选择性并有效地扩增新抗原反应性TILs，不仅提高了其频率，还拓宽了其克隆谱系，从而实现了对新抗原反应性TCR的高灵敏度分离。更重要的是，这种方法能够促使新抗原反应性TILs维持干细胞样记忆表型，减少耗竭，最终在体内外均展现出更强的抗肿瘤功能。因此，NeoExpand为优化过继性细胞疗法提供了两个关键路径：一是作为更高效的TCR发现平台，有助于开发针对多种新抗原/HLA组合的TCR工程化疗法，以应对肿瘤的免疫逃逸；二是直接作为制备具有高反应性和良好表型的“多克隆”TIL输注产品的新方法，这些产品能够同时靶向多个新抗原，降低治疗失败风险。

本研究的亮点突出体现在以下几个方面：第一，方法学的创新性：NeoExpand是一种全新的、抗原特异性的TIL体外扩增策略，它系统性地解决了传统非特异性扩增导致的目标细胞丢失和表型恶化问题。第二，研究设计的系统性：工作从临床问题出发，涵盖了方法开发、机制探索（表型分析）和功能验证（体内外疗效）的全链条，证据环环相扣，说服力强。第三，重要的科学发现：研究不仅证明了新抗原特异性刺激的有效性，更重要的是通过单细胞测序揭示了该方法能富集并维持具有干细胞样记忆表型的新抗原反应性T细胞，这为理解如何制备具有持久疗效的细胞产品提供了关键见解。第四，明确的转化医学价值：研究直接指向临床应用的改进，无论是用于TCR发现还是TIL产品制备，NeoExpand都有望使更多含有稀少、耗竭新抗原反应性T细胞的实体瘤患者受益于过继性细胞治疗。此外，研究还指出，与基于四聚体分选或仅凭转录组签名识别的方法相比，NeoExpand具有无需预先精确知晓表位序列、可同时用于CD4+和CD8+ T细胞、并能实现细胞扩增以备治疗等综合优势。这项研究为肿瘤免疫治疗，特别是实体瘤的过继性细胞疗法领域，贡献了一个具有重大潜力的新技术平台，其临床转化值得期待。