一篇关于利用光触发分子构象变化与氢键相互作用在活细胞中实现肽纳米颗粒向纳米纤维可控自组装的研究报告
研究作者及发表信息
本研究由来自第三军医大学国家免疫生物制品工程技术研究中心的孙思、邹全明以及国家纳米科学中心中国科学院纳米生物效应与安全性重点实验室的梁宏文、王浩等人共同完成。通讯作者为王浩与邹全明。该研究成果于2022年11月10日在线发表于《ACS Nano》期刊（ACS Nano 2022, 16, 18978−18989），题为《Light-Triggered Self-Assembly of Peptide Nanoparticles into Nanofibers in Living Cells through Molecular Conformation Changes and H‑Bond Interactions》。
研究背景与目的
分子自组装（Molecular Self-Assembly）是生物医学应用中制备功能性材料最具吸引力的策略之一。在自然界中，DNA复制、蛋白质折叠等生命基本过程均依赖于非共价力来引导结构转变。受此启发，研究人员开发了大量基于肽的人工自组装材料。然而，在活细胞中实现对肽自组装过程的高时空精度（Spatial and Temporal Precision）控制仍是一项巨大挑战。现有的控制方法多依赖于酶、pH、温度等内源性生物标志物，受限于正常组织与肿瘤组织之间生理条件的显著差异。此外，传统的光触发系统多使用光裂解保护基团或光致变色单元，其裂解反应残留物或环化反应的氧消耗可能对活细胞有害，且响应速度较慢。
本研究旨在开发一种新型光触发平台，通过微妙的分子构象变化（Molecular Conformational Changes）和内部氢键相互作用（H-bonding Interactions），而非光化学反应，在活细胞内实现从非功能性纳米颗粒（Nanoparticles）到功能性纳米纤维（Nanofibers）的时空精确可控自组装，并以此调控细胞行为。
研究设计与工作流程
为实现上述目标，研究团队设计合成了一个名为M-Q-IO-P的两亲性分子平台。该分子由三个关键功能单元整合而成，并通过固相合成法（Solid-Phase Synthesis）制备，其结构经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）确认。
其一为靶向肽（Targeting Peptide）RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸），可特异性结合肿瘤细胞表面过表达的整合素αvβ3（Integrin αvβ3），介导细胞的内吞作用（Receptor-mediated Endocytosis）。其二为提供强分子间氢键的肽序列KLVFF（赖氨酸-亮氨酸-缬氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸），该序列源自淀粉样β蛋白（Amyloid β）片段，是组装成纳米纤维的核心驱动力。其三为光响应单元（Light-Responsive Unit）M-Q-IO衍生物，该单元包含供体（Donor）与受体（Acceptor），可在特定波长光照下通过单键旋转发生从局部激发态（Locally Excited, LE）到扭曲分子内电荷转移态（Twisted Intramolecular Charge Transfer, TICT）的构象转变，从而改变整个分子的亲水亲脂平衡（Hydrophilic/Lipophilic Balance, HLB），触发解组装与重组的级联过程。通过芘荧光探针法测定，该分子的临界聚集浓度（Critical Aggregation Concentration, CAC）为17 μM。
研究流程主要包括体外表征、机理验证与活细胞功能评价三个层面。首先，研究者在M-Q-IO-P的水-二甲基亚砜混合溶液（体积比99:1）中形成聚集体（30 μM），利用365纳米、5毫瓦/平方厘米的紫外光照射20秒，系统研究了光触发下的光谱特性与形貌转变。通过紫外-可见吸收光谱（UV-Vis Absorption Spectra）、荧光光谱（Fluorescence Spectra）监测分子构象与聚集形态（H型聚集体到J型聚集体）的变化，利用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope, TEM）和动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）直接观察纳米颗粒到纳米纤维的形态演变和时间演化过程，并用圆二色光谱（Circular Dichroism, CD）和傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared, FTIR）分析肽二级结构从无序到β-折叠（β-Sheet）的转变。
其次，为阐明组装机制，研究者构建了两个核心对照分子：P2分子以GGAA序列替代原M-Q-IO-P中的FFVL序列，以消除强氢键作用；P3分子则不包含光响应单元M-Q-IO。通过对比它们的组装行为，证实了M-Q-IO单元通过分子构象变化打破亲水亲脂平衡驱使纳米颗粒解体，以及FF肽片段通过氢键重组引导纳米纤维形成的协同机制。此外，还利用硫黄素T（ThT）荧光探针和芬克-瓦茨基两步模型（Finke−Watzky Two-Step Model）对自然成核生长和光触发生长的动力学参数进行了定量比较。
最后，在活细胞层面，以高表达整合素αvβ3的三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231为模型，评价该平台调控细胞行为的能力。将M-Q-IO-P纳米颗粒与细胞共孵育，通过激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy, CLSM）和生物透射电子显微镜（Bio-TEM）观察其在无光和有光条件下的细胞内分布与形态。利用细胞划痕愈合实验（Scratch Healing Assay）和CCK-8法（Cell Counting Kit-8 Assay）分别评估光触发组装对细胞粘附迁移和细胞活力的影响。更进一步，结合顺铂（Cisplatin）药物，通过等效线图法（Isobologram）和皮尔逊相关系数（Pearson’s R Coefficient）分析，探索了该平台在破坏溶酶体功能、促进药物溶酶体逃逸（Lysosome Escape）及化疗增敏方面的协同效应。
主要研究成果与逻辑关联
体外光谱实验证实，M-Q-IO-P保留了M-Q-IO单元的光响应特性。紫外吸收光谱显示，光照后305纳米处的吸收峰下降，405纳米处的新峰出现并增强，标志着聚集体从H型堆积向J型堆积转变。荧光光谱在580纳米处的信号急剧增强，且从505纳米红移至580纳米，荧光量子产率从1.6%升至10.2%，荧光寿命由3.9纳秒降至1.1纳秒，均有力证明了TICT构象体和J型聚集体的形成。该光响应过程的转化率在20秒内可达85%，速率远快于已报道的体系。
TEM和DLS结果直观揭示了形貌转变的时空动态过程。初始分散均匀的纳米颗粒（平均尺寸24.3纳米）在光照20秒后，经历了类似奥斯特瓦尔德熟化（Ostwald Ripening）的过程，尺寸分布变得不均匀，小颗粒逐渐溶解并重新整合到大聚集体上。静置5分钟后，细小的纳米纤维开始出现，10分钟后形成致密的纳米纤维网络。作为对比，在无光照条件下，该转变过程需要3天。CD光谱证明，光照并静置10分钟后，β-折叠结构含量增加了32.1%，形成了高度有序的纤维结构。FTIR光谱中，无序结构对应的肩峰消失，取而代之的是归属于平行β-折叠的1629 cm⁻¹和1678 cm⁻¹等特征峰，进一步证实了肽链通过氢键重组进行有序排列。动力学分析显示，光触发组装的速率常数为0.17 min⁻¹，是自然成核生长速率（4.25 × 10⁻⁵ min⁻¹·μM⁻¹）的5450倍，展现了极高的时空可控性。
对照实验奠定了机制解释的基础。缺乏强氢键能力的P2分子光照后仅发生纳米颗粒的尺寸增大（52纳米增至170纳米），无法形成纳米纤维，说明氢键是重组为特定纤维形态的必要条件。而缺乏M-Q-IO单元的P3分子则直接自组装为纳米纤维，光照无影响，证实了M-Q-IO单元是光控解组装和触发形态转变的开关。M-Q-IO单元在光照后临界聚集浓度升高，表明其构象变化降低了疏水性，破坏了维持纳米颗粒稳定的亲水亲脂平衡。
细胞实验成功验证了该平台在活细胞中的时空精确调控功能。CLSM图像显示，在无光照的情况下，M-Q-IO-P纳米颗粒通过整合素介导的内吞途径进入细胞，并在2小时内主要定位于溶酶体中。然而，一旦施加20秒光照，细胞表面的纳米颗粒迅速转化为纳米纤维，并附着在细胞膜上，无法内化。SEM照片也捕捉到细胞膜上出现了不规则的棒状纤维结构。这一现象被命名为“光触发转变诱导的表面粘附”（Light-Triggered Transformation-Induced Surface Adhesion, LT-TISA）效应。细胞划痕实验显示，光照处理组的细胞迁移被显著抑制，24小时后划痕愈合率仅为76%，而对照组和未光照组分别为14%和17%，这说明表面生成的纳米纤维网络阻碍了细胞移动。
当纳米颗粒先内吞进入细胞溶酶体后再给予光照，Bio-TEM图像清晰地展现出溶酶体内从纳米颗粒到纳米纤维网络的形态变化。CCK-8实验表明，单独M-Q-IO-P在无光照时即使浓度高达320微摩尔也几乎没有细胞毒性，但在光照后，浓度超过80微摩尔时即表现出显著的毒性，并能诱导细胞凋亡而非坏死，其机制可能是纳米纤维的形成破坏了溶酶体的完整性。在顺铂增敏实验中，10微摩尔的M-Q-IO-P结合光照，可将顺铂对MDA-MB-231细胞的半数抑制浓度（IC50）从17.5 μM降低至2.9 μM，降幅达6倍，联合用药指数低至0.293（小于1即表示强协同作用）。机制研究表明，光触发的纤维组装导致溶酶体内容物（包括顺铂）泄漏到细胞质中，实现了药物溶酶体逃逸，从而极大增强了化疗效果。该功能的实现依赖于整合素αvβ3介导的内吞，其在整合素低表达的MCF-7细胞中效果明显减弱。
结论与研究价值
研究者成功开发了一种全新的光触发自组装平台，通过M-Q-IO分子的光控构象翻转和KLVFF肽的氢键重组，在活细胞内实现了纳米颗粒到纳米纤维的快速、时空精确的形态转换。该过程不产生化学废料、不消耗氧气，具有良好的生物相容性，且组装速率常数高达0.17 min⁻¹，远超传统自然组装过程。该平台不仅能在细胞表面实现光控粘附以抑制迁移，还能在溶酶体内部触发纤维化，从而破坏其功能、诱导细胞凋亡并实现化疗药物增敏。
本研究的意义在于提供了一种高精度调控活细胞内肽组装结构的通用策略，超越了传统依赖内源性条件或光化学反应的限制。它为动态、主动地调控细胞行为（如迁移、死亡）提供了有力工具，对理解生命过程中的动态结构-功能关系具有重要意义，并为开发新型纳米药物、尤其在克服肿瘤耐药性方面展现了巨大的应用前景。
研究亮点
此项研究的核心亮点体现在三个方面。首先是概念创新，它首次利用单键旋转的纯物理构象变化来触发超分子自组装，避免了传统光化学方法中副产物或活性氧的干扰，是一种更清洁、更生物友好的控制方式。其次是时空精度与速率，其组装响应速度（20秒内完成转化）和动力学常数远优于现存的内源性和光控体系，实现了真正的“光控开关”式调控。最后是功能的双向调控模式，该平台既能以纳米球形式被内吞后发挥胞内功能，也能在光照后原位形成纤维发挥胞外功能，实现了空间层面上的精准功能切换，如从抑制细胞迁移到增强药物疗效，展现了高度的功能灵活性和应用潜能。