本文旨在向各位研究人员介绍一篇发表于学术期刊 Microchimica Acta 上的原创性研究。这篇题为《基于核酸适体的电化学传感器用于血清p-tau231检测及阿尔茨海默病的即时筛查》的论文，为阿尔茨海默病的早期诊断提供了一种新颖、高效且经济的潜在解决方案。
第一， 研究作者、机构及发表信息 本研究由哈尔滨医科大学基础医学院的研究团队完成。主要作者包括孔庆飞、刘春晗、张炎林、何一凡、张瑞婷、王禹涵、周琴和崔飞云。其中，周琴教授和崔飞云教授为通讯作者。该研究于2024年5月在线发表在施普林格·自然（Springer Nature）旗下的学术期刊 Microchimica Acta 上，卷期为第191卷第328页（2024年）。
第二， 学术背景与研究目标 本研究的科学领域属于生物医学工程与临床诊断学的交叉领域，具体聚焦于电化学生物传感技术在神经退行性疾病生物标志物检测中的应用。
研究背景：阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）是一种进展性神经退行性疾病，全球每3秒就新增一名患者，给社会和个人带来沉重负担。目前临床诊断多依赖中晚期临床症状，而基于正电子发射断层扫描-计算机断层扫描（PET-CT）和脑脊液（Cerebrospinal Fluid, CSF）检测的辅助手段则存在成本高、有放射性或创伤性大等局限，不适合大规模人群早期筛查。因此，开发一种微创、高灵敏、低成本的血浆/血清检测技术至关重要。
在AD的生物标志物中，磷酸化tau蛋白（phosphorylated tau protein）在血液中展现出良好的应用前景。其中，苏氨酸231位点磷酸化的tau蛋白（p-tau231）在AD早期病理阶段就出现异常升高，其升高早于p-tau181和p-tau217等其他磷酸化形式，且与β-淀粉样蛋白（Aβ）聚集密切相关，被认为是早期筛查AD的理想生物标志物。然而，血清中p-tau231的含量极低（健康人约1.1-2.5 pg/mL，AD患者约3.8-6.4 pg/mL），现有高灵敏检测技术（如免疫沉淀质谱法、Simoa技术）设备复杂、成本极高，难以推广。
研究目标：为解决上述瓶颈问题，本研究旨在开发一种简单、低成本、高灵敏的基于核酸适体（Aptamer）的电化学生物传感器，用于检测血清中的痕量p-tau231蛋白，从而为AD的大规模人群早期筛查提供一种新方法。
第三， 详细研究流程 本研究包含生物传感器的构建、优化、性能评估及实际样本测试等一系列严谨的实验流程。
1. 生物传感器的构建与表征流程： * 研究对象与材料： 核心研究对象为p-tau231蛋白。使用的关键材料包括：玻碳电极（Glassy Carbon Electrode, GCE）、p-tau231特异性核酸适体（序列已给出，5’端巯基修饰）、氯金酸（用于合成金纳米粒子）、6-巯基-1-己醇（MCH，封闭剂）以及铁氰化钾/亚铁氰化钾（[Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻，电化学探针）。 * 实验步骤： a. 金纳米粒子修饰电极（AuNPs/GCE）的制备： 采用电沉积法，在含有1%氯金酸的溶液中，于-0.2 V恒定电位下沉积20秒，在抛光后的GCE表面原位生长金纳米粒子。 b. 电极表征： 使用扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线光谱（EDS）对修饰前后的电极表面形貌和元素组成进行表征。SEM图像显示，沉积后的电极表面均匀覆盖了类似爆米花状的、尺寸小于200纳米的金纳米球，显著增大了电极比表面积。EDS图谱证实了金元素的存在。 c. 适体固定化： 将1 μM的巯基化p-tau231适体滴涂到AuNPs/GCE表面，通过Au-S键在4°C下固定16小时。 d. 封闭非特异性位点： 使用1 mM的MCH溶液孵育1小时，封闭电极表面剩余的活性位点，减少非特异性吸附。 e. 目标蛋白捕获： 将待测的p-tau231蛋白溶液滴加至修饰好的电极表面，在37°C下孵育60分钟，使适体与目标蛋白特异性结合形成复合物。 * 电化学检测方法： 整个构建过程及后续检测均采用三电极系统（工作电极：修饰后的GCE；参比电极：饱和甘汞电极；对电极：铂丝电极），并主要使用差分脉冲伏安法（Differential Pulse Voltammetry, DPV）和电化学阻抗谱（Electrochemical Impedance Spectroscopy, EIS）进行监测和测量。检测在含有[Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻探针的溶液中进行。
2. 实验条件优化流程： 为确保传感器性能最优，研究者系统优化了多个关键参数。优化过程均通过比较DPV电流响应信号（ΔI）的变化来确定。 * 金纳米粒子电沉积条件优化： 分别测试了沉积时间（5-30秒）和沉积电位（-0.6 V 至 -0.2 V）。结果表明，在-0.2 V电位下沉积20秒时，电极的电流响应信号最强，导电性和比表面积达到最佳。 * 适体浓度优化： 测试了0.25至4 μM不同浓度的适体。发现1 μM的适体浓度下，传感器对1 μg/mL p-tau231的电流变化响应最大。浓度过高会导致适体在电极表面过于密集，反而妨碍蛋白质结合和电子传递，降低灵敏度。 * 蛋白孵育时间优化： 测试了不同孵育时间（至90分钟）。结果显示，孵育60分钟后电流变化值达到最大并趋于稳定，故选择60分钟为最佳孵育时间。 * 溶液pH值优化： 测试了pH 5至9的磷酸盐缓冲液（PBS）。在pH=7时，传感器对p-tau231的响应信号最大，表明该pH下适体与抗原的结合效率最高。
3. 传感器分析性能评估流程： * 线性范围与检出限（Limit of Detection, LOD）测定： 在最优条件下，用传感器检测PBS中一系列不同浓度的p-tau231蛋白（10 pg/mL 至 1 μg/mL，即10⁷ pg/mL）。记录DPV峰值电流的变化。将电流变化值（ΔI）与p-tau231浓度对数值进行线性拟合，得到标准曲线。根据国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）标准计算检出限。 * 选择性测试： 为验证传感器的特异性，选取了血清中常见的蛋白质（牛血清白蛋白BSA、γ-球蛋白、纤维蛋白原）、AD相关标志物（Aβ42）以及其他疾病标志物（癌症抗原CA19-9）作为干扰物。测试了传感器对高浓度（10倍于p-tau231）干扰物和低浓度p-tau231的响应，比较其电流变化值。 * 稳定性、重复性与重现性测试： * 稳定性： 将制备好的传感器（未孵育蛋白）在4°C储存，连续7天进行DPV测试，观察电流信号衰减情况。 * 重复性： 用同一个制备好的传感器，对同一浓度（1 μg/mL）的p-tau231蛋白连续进行10次DPV检测，计算相对标准偏差（RSD）。 * 重现性： 使用6个独立的GCE，分别按照相同流程制备6个传感器，用于检测相同浓度的p-tau231，计算其响应电流的RSD。
4. 实际临床样本应用流程： * 样本处理： 采集健康志愿者血清，用PBS稀释10倍以降低基质复杂性。 * 加标回收实验： 采用标准加入法，在稀释后的血清样本中加入三种不同浓度（100 pg/mL, 1 ng/mL, 100 ng/mL）的p-tau231标准品。 * 检测与分析： 使用所构建的生物传感器对这些加标血清样本进行检测，根据PBS中得到的标准曲线计算检测出的蛋白浓度，进而计算回收率（Recovery）和RSD，以评估传感器在复杂实际样本中的准确性和可靠性。
第四， 主要研究结果 本研究取得了系列明确且具有说服力的结果，每一步结果都逻辑清晰地支撑了后续研究并最终导向结论。
1. 传感器构建表征结果： SEM和EDS结果直观证实了金纳米粒子成功、均匀地修饰在电极表面。DPV和EIS的实时监测结果清晰地展示了传感器构建每一步的成功：沉积AuNPs后，电流信号显著增强，阻抗降低；固定适体后，因适体阻碍电子传递，电流减小，阻抗增大；用MCH封闭后，此效应进一步加强；最后孵育p-tau231蛋白形成适体-抗原复合物，对电子传递的阻碍最大，电流降至最低，阻抗最高。这一系列规律性的变化证实了传感器按预期成功构建，且具有良好的电化学性能。
2. 优化结果： 通过系统优化，确定了传感器工作的最佳条件组合：沉积电位-0.2 V、沉积时间20秒、适体浓度1 μM、蛋白孵育时间60分钟、溶液pH=7。这些结果为传感器实现最高检测灵敏度奠定了基础。
3. 分析性能结果： * 灵敏度与线性范围： 传感器在10 pg/mL 至 1 μg/mL（10⁷ pg/mL）的极宽浓度范围内表现出优异的线性响应。拟合的标准曲线方程为 y (μA) = -0.30517 + 2.22856 x (pg/mL)，相关系数R²高达0.999。计算出的检出限低至2.31 pg/mL。这一性能完全覆盖并优于临床所关注的血清p-tau231浓度范围（健康与患者水平），且灵敏度显著高于文献报道的荧光适体传感器（LOD 3.64 ng/mL）和电化学免疫传感器（LOD 140 pg/mL）。 * 选择性： 选择性测试结果非常显著。在含有高浓度多种干扰蛋白的溶液中，传感器仅对p-tau231产生强烈的电流变化响应，而对BSA、Aβ42、CA19-9、γ-球蛋白和纤维蛋白原的响应与空白对照相近。这强有力地证明了所用核酸适体对p-tau231的高度特异性，确保了传感器在复杂血清环境中准确识别目标物的能力。 * 稳定性、重复性与重现性： 稳定性测试显示，传感器在7天后电流信号衰减约11.87%，表明其在一周内具有可接受的稳定性。重复性测试中，10次连续测量的RSD为3.27%，证明单个传感器的检测可靠性高。重现性测试中，6个独立传感器检测的RSD为8.08%，表明该制备方法在不同电极间具有良好的重现性和一致性。
4. 实际样本应用结果： 在加标回收实验中，传感器对血清中三种不同浓度的p-tau231的检测回收率在97.59%至103.26%之间，所有RSD均小于10%。这表明即使在成分复杂的血清基质中，该传感器依然能保持高准确度和精密度，具备应用于实际临床样本检测的巨大潜力。
第五， 研究结论与价值 本研究成功开发了一种基于核酸适体和金纳米粒子放大的新型电化学生物传感器，用于超灵敏检测血清中的AD早期生物标志物p-tau231。
科学价值： 1. 方法学创新： 首次报道了使用核酸适体（而非传统抗体）构建用于检测p-tau231的电化学生物传感器。适体具有成本低、稳定性高、易修饰等优势。 2. 性能突破： 该传感器实现了对p-tau231的宽线性范围（10-10⁷ pg/mL）和极低检出限（2.31 pg/mL），其综合检测性能优于目前已报道的同类生物传感器。 3. 机理验证： 研究通过系统的电化学表征和条件优化，详细阐明了金纳米粒子增强信号、适体特异性识别以及电子传递阻抗变化的传感机制。
应用价值： 1. 为AD早期筛查提供新工具： 该传感器简单、快速、成本低、灵敏度高、所需样本量少，且适用于血清样本，完美契合了大规模人群早期筛查对检测技术的要求。 2. 推动液体活检发展： 作为生物传感技术在液体活检领域的成功应用案例，该研究为其他痕量疾病标志物的检测提供了可借鉴的思路和技术路线。 3. 具备临床转化潜力： 优异的特异性、稳定性以及在真实血清样本中验证的高回收率，均表明该传感器有希望进一步开发成为临床诊断或居家监测的潜在工具。
第六， 研究亮点 1. 目标标志物前沿： 聚焦于AD极早期、最具预测价值的生物标志物p-tau231，研究方向具有前瞻性和重要的临床意义。 2. 传感策略巧妙： 结合了金纳米粒子的信号放大效应与核酸适体的高特异性识别能力，构建了“AuNPs-适体”协同作用的传感界面。 3. 综合性能卓越： 在灵敏度、线性范围、选择性、稳定性和实际样本适用性等方面均表现出色，各项指标平衡且实用。 4. 工作系统完整： 研究从传感器设计、构建、优化、性能评估到实际样本验证，形成了一个闭环、系统且严谨的完整研究体系。
第七， 其他有价值内容 论文在讨论部分还对比了本研究传感器与其他已报道检测方法（如荧光适体传感器、比色适体传感器、电化学免疫传感器）的性能参数，通过表格形式清晰展示了本研究在检测限和线性范围上的优势，增强了论文的说服力。此外，研究对所有使用的缩写进行了完整定义，并提供了详尽的参考文献，体现了研究的规范性和学术严谨性。