数字微流控与二氧化钛纳米颗粒辅助激光解吸电离质谱联用平台在微生物分析中的应用研究

作者及发表信息
本研究由北京理工大学的Boyu Li、Hang Li（通讯作者）、Chao Yang等团队合作完成，发表于《Analytical Chemistry》2025年第97卷（页码20918-20927）。研究团队来自北京理工大学医学技术学院、郑州研究院及重庆微电子与微系统研究所等多个机构。

学术背景
本研究属于微流控技术与质谱分析交叉领域。传统基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）在微生物代谢物分析中面临小分子代谢物（m/z < 500 Da）检测的基质干扰问题，而数字微流控（Digital Microfluidics, DMF）技术虽已与电喷雾电离质谱（ESI-MS）联用，但其与激光解吸电离（LDI-MS）的整合仍存在技术空白。因此，本研究旨在开发一种集成DMF与LDI-MS的自动化平台，结合二氧化钛（TiO₂）纳米颗粒替代传统基质，以消除干扰并提升微生物代谢分析的灵敏度和效率。

研究流程与方法
1. 平台设计与构建
- DMF芯片改造：在芯片顶部基底修饰亲水点（hydrophilic spot），通过聚二甲基硅氧烷（PDMS）覆盖法实现，接触角从113.2°降至79.45°，确保液滴精准捕获。
- LDI适配器开发：设计带凹槽的适配器靶板，解决因玻璃基底厚度导致的质荷比（m/z）偏移问题（如维拉帕米标准品峰从m/z 453.979偏移至452.209）。
- TiO₂纳米颗粒优化：筛选粒径（5-100 nm）和浓度（0.25%-10% w/v），确定20 nm、0.5% w/v的TiO₂纳米颗粒可最大化信号强度（维拉帕米检测限达2.86×10⁻⁷ mol/L，动态范围3个数量级）。

1. 微生物样本处理

   • 细菌指纹图谱分析：临床分离的大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）经DMF芯片自动化裂解（70%甲酸）与基质（HCCA）混合，通过亲水点捕获后直接进行LDI-MS检测。
     
   • 代谢物提取：采用甲酸-正丁醇（FA-NBA）和乙腈-异丙醇（ACN-IPA）两种溶剂提取极性/非极性代谢物，结合TiO₂纳米颗粒消除基质干扰。
     

2. 质谱分析

   • 使用Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF质谱仪，正离子模式检测，通过总离子流（TIC）归一化定量代谢物表达差异。
     

主要结果
1. 平台性能验证
- 维拉帕米检测灵敏度与常规MALDI-MS相当，但背景干扰显著降低（图3a）。
- 细菌指纹图谱分析成功鉴定E. coli DH5α和肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae），准确率与标准靶板一致（图4b-d）。

1. 代谢物差异分析
   
   • 从E. coli中检出尿嘧啶（uracil, m/z 113.034）、苯丙酮酸（phenylpyruvic acid, m/z 165.030）等代谢物（图5）。
     
   • 物种特异性标志物：E. coli中丙氨酰-丙氨酸（alanyl-alanine, m/z 161.093）表达量显著高于S. aureus（p<0.01），而S. aureus中吲哚啉（indoline, m/z 120.107）更丰富（图6c-h）。
     

结论与价值
1. 科学价值
- 首次实现DMF与LDI-MS的无缝集成，解决了小分子代谢物检测的基质干扰问题。
- 揭示了E. coli和S. aureus的代谢差异，为微生物快速分型提供新策略。

1. 应用价值
   
   • 自动化样本处理（8分钟内完成）和低样本消耗（1 μL）使其适用于临床诊断和高通量药物筛选。
     
   • TiO₂纳米颗粒的引入拓展了LDI-MS在微生物代谢组学中的应用潜力。
     

研究亮点
1. 技术创新
- 亲水点修饰和适配器靶板设计解决了DMF与LDI-MS联用的接口问题。
- 20 nm TiO₂纳米颗粒优化了激光能量传递效率，提升电离效能。

1. 发现创新
   
   • 丙氨酰-丙氨酸作为革兰氏阴性菌潜在生物标志物的发现，为微生物鉴定提供了新依据。
     

其他价值
- 研究团队已申请中国专利（ZL202410891515.9），为技术转化奠定基础。
- 平台可扩展至其他微生物或宿主-微生物互作研究，如代谢通路调控机制解析。

（注：全文基于原文内容整合，专业术语如DMF、LDI-MS等首次出现时标注英文，数据引用自原文图表及附表。）