类型a：学术研究报告
以下是对Diana Cadena Castaneda等作者在《STAR Protocols》期刊（2023年12月15日发表）关于”从冷冻保存的人肺组织建立原代肺类器官-气液界面培养体系”研究的详细报告。
一、研究团队与发表信息
本研究由美国杰克逊基因组医学实验室（The Jackson Laboratory for Genomic Medicine）的Diana Cadena Castaneda、Adam Williams、Karolina Palucka团队主导，联合西奈山伊坎医学院（Icahn School of Medicine at Mount Sinai）的病毒学专家共同完成。通讯作者联系方式分别标注为adam.williams@northwestern.edu和karolina.palucka@jax.org。
二、学术背景
1. 研究领域：
本研究属于呼吸道疾病研究领域，聚焦于建立功能性体外人类气道模型。新型冠状病毒（SARS-CoV-2）疫情暴发后，亟需能模拟人体真实呼吸道环境的实验平台。传统二维细胞培养无法再现气道上皮的复杂结构和功能特性。
背景知识：
原代肺类器官（primary lung organoids）是目前最具生理相关性的体外模型，能保留供体组织的遗传和表型特征。气液界面（Air-Liquid Interface, ALI）培养可促进上皮细胞分化形成假复层结构，但现有技术面临两大挑战：（1）新鲜组织来源受限；（2）冻存组织复苏后存活率低。
研究目标：
开发标准化流程，实现从冷冻保存肺组织→类器官扩增→ALI分化→病毒感染研究的全链条技术体系，并以SARS-CoV-2为例验证其应用价值。
三、实验流程与方法创新
研究包含6个关键技术环节，耗时约6个月：
- 肺组织处理与冷冻保存（2天）
- 样本来源：通过美国国家疾病资源中心（NDRI）获取经伦理审查的去标识化人肺组织
- 解剖处理：按肺泡区（la标签）和支气管区（lb标签）分离组织，3×3cm³切片
- 冻存方案：采用含10%二甲基亚砜（DMSO）的胎牛血清（FBS）冷冻液，梯度降温后液氮保存
- 质量控制：同步保存OCT包埋样本用于组织学验证
- 冻存组织复苏与类器官培养（4个月）
- 酶解方案：采用胶原酶I（1-2mg/ml）联合机械剪切法获得单细胞悬液
- 三维培养：将7.5×10⁵ cells/ml密度接种于Cultrex基质胶，使用含R-spondin1/FGF7/FGF10等11种因子的气道上皮培养基（AO media）
- 传代优化：每2周用TrypLE解离，4-7代后获得无结缔组织残留的纯化类器官
- 关键创新：开发5%BSA预包被技术防止类器官粘附，存活率提升至80-90%
- ALI培养体系建立（6周）
- 三阶段分化：
(1) 扩增期：含Y-27632（Rho激酶抑制剂）的PneumaCult-Ex Plus培养基，10-12天达100%融合
(2) 分化I期：TEER（跨上皮电阻）监测>500Ω·cm²时转换分化培养基
(3) 分化II期：气升式（airlift）培养4周，形成含纤毛细胞和杯状细胞的假复层上皮
- 病毒感染模型构建
- SARS-CoV-2毒株：包括原始株（USA/WA1-2020）和β/δ/ο变异株
- 感染方案：105 PFU接种（MOI=0.1），每日采集1-6天（dpi）样本
- 预实验确认：通过免疫荧光检测核衣壳蛋白（NP）证实34%感染率（6 dpi）
- 多维数据分析
- 转录组：Zymo Direct-zol RNA提取→KAPA文库构建→Illumina测序→RSEM/DESeq2分析
- 流式细胞术：Cytofix/Cytoperm固定后，用1C7C7抗体检测NP+细胞
- 病毒滴度：VeroE6/TMPRSS2细胞空斑试验
- 空间转录组：NanoString GeoMx DSP全转录组分析
- 质量控制体系
- 免疫荧光panel：
• 上皮标记：泛细胞角蛋白（pan-CK）
• 病毒检测：NP/S蛋白
• 功能标记：MUC5AC（粘液分泌）、acetyl-α-tubulin（纤毛）
- TEER动态监测：使用EVOM2电阻仪建立质量阈值
四、主要研究结果
1. 冷冻保存技术验证：
- 肺泡/支气管区组织冻存6个月后仍保持活力（图1）
- 显微解剖确认区域特异性结构保存完整（H&E染色）
- 类器官培养体系：
- 传代4-7次后纤维连接蛋白（fibronectin）阴性，pan-CK阳性率>95%（图2C）
- 单细胞冻存复苏效率达75±8%（n=4供体）
- ALI分化特征：
- TEER峰值达1287±156 Ω·cm²（n=4）
- 免疫荧光证实存在：
• SCGB1A1+俱乐部细胞（图5A绿色）
• 乙酰化α-tubulin+纤毛细胞（红色）
• MUC5AC+杯状细胞（青色）
- SARS-CoV-2感染模型：
- 病毒复制动力学：
• 24h潜伏期→3dpi达峰值（105.2PFU/ml）→6dpi下降
• δ株复制效率最高（比ο株高2.3倍）
- 宿主反应：
• RNA-seq显示CSF3（G-CSF）上调82倍
• 空间转录组定位CCL20表达于基底细胞
五、研究价值与结论
1. 科学价值：
- 首次系统建立从冻存组织到ALI培养的全流程方案
- 揭示不同SARS-CoV-2变异株在分呼吸道模型中的复制差异
- 应用价值：
- 为偏远地区样本保存提供标准化方案（关键步骤视频已附加）
- 支持个性化医疗：不同供体来源模型反映个体差异
- 扩展应用：适用于流感、RSV等呼吸道病毒研究
六、研究亮点
1. 技术创新：
- 开发”解剖区域标签系统”（la/lb）保持样本溯源性
- 优化气升培养时间（4周）较传统方案缩短30%
- 方法学突破：
- 整合流式细胞术（感染率定量）+显微切割（空间转录组）+ bulk RNA-seq（通路分析）
- 建立自动化TEER监测标准（>500Ω·cm²阈值）
- 资源开放：
- 所有实验方案、抗体列表（含RRID）和测序数据（GSE225603）已公开
- 提供分步故障排除指南（如：胶原酶浓度调整策略）
七、其他贡献
1. 安全规范：
- 明确BSL-2/3实验室操作分界（如：活病毒实验必须在BSL-3进行）
2. 替代方案：
- 推荐丙酮固定替代PFA的方案，适用于无通风设备实验室
3. 设备适配：
- 验证EVOM2电阻仪与Corning Transwell的兼容性参数
本研究为呼吸道疾病研究提供了标准化工具，其模块化设计允许各实验室根据条件调整具体参数（如冻存液配方），同时保持核心流程的一致性。作者特别强调应遵守所在机构的生物安全指南，所有涉及活病毒的实验需在相应防护等级下开展。