关于Tregs携带有MHC II类肽特异性嵌合抗原受体可预防小鼠自身免疫性糖尿病的研究报告
本研究报告由美国明尼苏达大学医学院的Justin A. Spanier、明尼苏达大学和加拿大英属哥伦比亚大学的联合团队（Vivian Fung等为共同第一作者，Brian T. Fife和Megan K. Levings为共同资深作者）共同完成，研究成果以《Tregs with an MHC class II peptide–specific chimeric antigen receptor prevent autoimmune diabetes in mice》为题，于2023年8月10日发表在期刊《The Journal of Clinical Investigation》上。
一、 学术背景 本研究属于免疫学和自身免疫疾病治疗领域，重点关注1型糖尿病（Type 1 diabetes, T1D）。T1D是一种由自身反应性T细胞破坏胰腺胰岛β细胞导致的自身免疫疾病。调节性T细胞（Regulatory T cells, Tregs）是一类表达Foxp3转录因子的CD4+ T细胞，其核心功能是抑制效应T细胞的反应，维持免疫耐受，防止自身免疫的发生。然而，在T1D患者体内，Tregs存在功能异常，这促使研究者探索通过恢复或增强Treg功能来治疗自身免疫疾病的策略。
前期研究表明，在T1D动物模型中，胰岛抗原特异性的Tregs比多克隆Tregs能更有效地预防疾病。但临床应用中，获取足够数量、高纯度的抗原特异性Tregs是一大挑战。传统方法如利用T细胞受体（T cell receptor, TCR）进行基因工程改造存在TCR链错配、亲和力限制等问题。作为一种替代方案，嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor, CAR）技术被用于重定向T细胞特异性。CAR通常由识别抗原的单链抗体可变区（scFv）和细胞内信号域（如CD28和CD3ζ）构成，具有高亲和力、不依赖主要组织相容性复合物（MHC）等优点，已成功应用于癌症治疗和部分移植排斥模型。
本研究团队假设，为Tregs装备一种能够特异性识别由MHC II类分子（在非肥胖糖尿病小鼠（NOD）中为I-Ag7）呈递的胰岛抗原肽的CAR，可以精确地将Tregs引导至抗原呈递部位，从而在局部高效抑制自身免疫反应，预防T1D。他们选择胰岛素B链第10-23位氨基酸肽段（Insulin B 10-23, InsB10-23）作为靶点，因为针对该表位的CD4+ T细胞已被证实能够诱发NOD小鼠的糖尿病。本研究的目标是：1）开发一种特异性识别InsB10-23:I-Ag7复合物的单克隆抗体（mAb）；2）将此抗体改造为CAR（命名为InsB-G7 CAR）；3）验证工程化CAR Tregs在体外和体内的特异性、激活状态和抑制功能；4）最终在NOD小鼠的适应性转移糖尿病模型和自发性糖尿病模型中，评估InsB-G7 CAR Tregs预防疾病的能力。
二、 研究流程详述 本研究包含几个紧密衔接的步骤，逻辑清晰。
流程一：靶向性单克隆抗体（1B2）的生成与验证。 * 研究对象与方法： 首先，研究团队使用含有InsB10-23修饰肽（InsBp8E和InsBp8G）的重组I-Ag7分子免疫NOD小鼠，随后制备B细胞杂交瘤。从中筛选出一个名为UMN-BF-1B2（简称1B2）的杂交瘤株，其分泌的IgG1抗体被用于后续研究。 * 实验与验证： 1. 特异性验证： 通过流式细胞术证实，1B2抗体能特异性结合含有InsBp8E或InsBp8G的I-Ag7四聚体，但不能结合装载无关肽的四聚体。用荧光标记的1B2染色肽段脉冲的树突状细胞（DCs），结果显示其对InsBp8E的染色强度显著高于对照。 2. 亲和力测定： 使用生物层干涉技术测得1B2对InsBp8E:I-Ag7的亲和力（KD = 8.5 × 10–9 M）高于对InsBp8G:I-Ag7的亲和力（KD = 2.7 × 10–8 M）。 3. 功能阻断验证： 在体外共培养实验中，加入1B2抗体能显著抑制InsB10-23特异性TCR转基因T细胞（8F10细胞）对合成肽或NOD胰岛提取物刺激产生的增殖反应。同样，1B2也能抑制另一个InsB10-23特异性T细胞杂交瘤（AS150）在抗原呈递细胞存在下的增殖。这些实验证明1B2抗体能够识别并阻断自然加工和呈递的InsB10-23抗原，具备高特异性。
流程二：InsB-G7 CAR的构建与CAR Tregs的表征。 * CAR构建： 将1B2抗体的重链和轻链可变区序列连接成scFv，并克隆到逆转录病毒载体中。scFv上游添加了Myc表位标签，下游依次连接小鼠CD8α的铰链区、小鼠CD28的跨膜区，以及CD28和CD3ζ的细胞内信号域。 * CAR Tregs的制备与表征： 1. 细胞制备： 从NOD.Foxp3EGFP报告小鼠中分选出Foxp3+ Tregs，用上述构建的逆转录病毒进行转导，同时设未转导的Tregs作为对照。转导后细胞进行体外扩增。 2. 纯度与表型： 流式分析显示，扩增后的CAR Tregs中超过90%表达Foxp3，大部分同时表达Treg谱系另一标志物Helios，表明CAR转导未破坏Treg的核心表型。 3. CAR表达与特异性： 通过抗Myc标签染色确认CAR表达。更重要的是，InsB-G7 CAR Tregs能特异性结合InsBp8E:I-Ag7四聚体，而不能结合无关肽（2.5HP）的I-Ag7四聚体，证明改造后的CAR保留了原始抗体对肽-MHC复合物的特异性。
流程三：体外功能验证——CAR T细胞的激活、增殖与抑制能力。 * 激活与增殖： 1. 对合成肽的反应： 将CAR Tregs或CAR传统T细胞（Tconvs）与经InsBp8E或对照肽脉冲的NOD脾细胞共培养。结果显示，InsB-G7 CAR Tregs和Tconvs均能在InsBp8E刺激下发生显著增殖，而对照Tregs则无此反应。Tconvs的增殖幅度大于Tregs，这与Tregs低增殖的特性一致。 2. 对天然抗原的反应： 将CAR Tconvs与T细胞耗竭的NOD脾细胞及NOD胰岛共培养。约30%的InsB-G7 CAR Tconvs在胰岛存在下发生增殖，而对照Tconvs则无。这表明CAR能够识别胰岛来源的、经自然加工呈递的InsB10-23抗原。 3. 体内初步激活： 将CAR Tconvs过继转移至年轻NOD小鼠，7天后分析发现，约20%的CAR Tconvs上调了激活标志PD-1，而未接受抗原刺激的对照组则无此现象。若同时给予InsBp8E肽和LPS免疫，PD-1阳性率可升至近60%。这证明InsB-G7 CAR能在体内感知胰岛来源的抗原并激活T细胞。 * 抑制功能（旁观者抑制）： 1. 激活标志上调： 当InsB-G7 CAR Tregs与InsBp8E脉冲的抗原呈递细胞共培养后，其表面激活标志CD69、LAP以及抑制分子CTLA-4的表达均显著上调。 2. 调制抗原呈递细胞： CAR Tregs与经InsBp8E脉冲的DCs共培养后，能显著降低DCs表面共刺激分子CD80和CD86的表达，这被认为是Treg通过反式内吞作用抑制APC功能的关键机制。 3. 抑制效应T细胞： 建立了体外“旁观者抑制”实验体系：先将CAR Tregs与同时载有InsBp8E（刺激CAR）和BDC2.5 TCR特异性肽（p63，刺激效应T细胞）的DCs共孵育，再加入BDC2.5效应T细胞。结果显示，InsB-G7 CAR Tregs在CAR被刺激的情况下，能比对照Tregs更有效地抑制BDC2.5 T细胞的增殖和IL-2产生。
流程四：体内疗效评估——预防适应性转移糖尿病。 * 模型建立： 将50,000个初始BDC2.5 CD4+ T细胞（致病性效应T细胞）单独或与不同数量（3:1或9:1比例）的对照Tregs或InsB-G7 CAR Tregs共同过继转移至免疫缺陷的NOD.Rag1–/–受体小鼠。 * 结果与分析： 1. 疾病预防： 仅接受BDC2.5 T细胞的小鼠在14天内全部发生糖尿病。而共同输注InsB-G7 CAR Tregs的小鼠得到了完全保护，无一发病。相比之下，共同输注对照Tregs的小鼠仅部分得到保护，仍有相当比例发病。这表明InsB-G7 CAR Tregs的疗效显著优于非特异性的多克隆Tregs。 2. 细胞动力学与表型： 在疾病发生时或输注后30天分析小鼠脾脏和胰腺引流淋巴结。发现接受高剂量（9:1）CAR Tregs的小鼠脾脏中，CD45.2+ CAR Tregs的数量最多。进一步分析显示，其中能结合InsBp8E四聚体的CAR阳性Tregs亚群，相比CAR阴性亚群，表达了更高水平的增殖标志Ki67以及激活/抑制标志PD-1和CTLA-4，说明这些CAR Tregs在体内被抗原持续激活并维持抑制性表型。 3. 对效应T细胞的影响： CAR Tregs治疗显著减少了脾脏和淋巴结中BDC2.5 T细胞的数量，并降低了其中能同时产生IFN-γ和TNF-α的多功能效应细胞的比例。 4. 胰腺病理改善： 免疫荧光染色显示，在CAR Tregs治疗的小鼠胰腺中，可见Foxp3+ CAR Tregs定位于胰岛附近、胰岛周围炎性浸润区甚至胰岛内部。组织学定量分析表明，CAR Tregs治疗显著减少了BDC2.5 T细胞在胰岛周围的浸润面积。
流程五：体内疗效评估——预防自发性糖尿病。 * 模型建立： 向8-10周龄（已出现自身抗体和明显胰岛炎，相当于人T1D的Stage 1）的雌性NOD小鼠单次注射250-300万InsB-G7 CAR Tregs或对照缓冲液，并监测至30周龄。 * 结果： 对照组小鼠的糖尿病发病率与历史数据一致，约80%在30周龄前发病。而接受单次CAR Tregs输注的小鼠，糖尿病发病率显著降低，仅为43%（3/7）。尽管在实验终点（30周）时已无法检测到供体来源的CD45.2+细胞，但单次治疗产生的保护效应持续了数月之久。
三、 主要结果及其逻辑关系 本研究的结果环环相扣，形成了完整的证据链。首先，成功获得高特异性、能阻断天然抗原反应的1B2单抗，为构建高精度靶向工具奠定了基础。接着，将该抗体成功改造为CAR，并证明其能在Tregs上稳定表达，且不改变Treg的核心身份和抑制潜能。体外实验证明，该CAR Tregs不仅能被合成肽有效激活，更重要的是能响应胰岛来源的天然抗原，并在激活后上调抑制分子、增强对APC的调制能力和对无关效应T细胞的“旁观者抑制”能力。这为体内疗效提供了机理上的预演。
体内实验的结果完美印证了体外发现。在适应性转移模型中，CAR Tregs显示出远超对照Tregs的保护效力，并且保护效果与CAR Tregs在次级淋巴器官（特别是胰腺引流淋巴结）的累积和激活状态正相关。这些活化的CAR Tregs有效抑制了致病性T细胞的扩增、效应功能以及向胰腺的浸润。最终，在更接近人类疾病自然进程的自发性糖尿病模型中，单次输注CAR Tregs即能长期显著延缓疾病发生，证明了其强大的治疗潜力和持久的免疫调节效果。
四、 结论与意义 本研究的结论是：利用一种TCR样、特异性针对肽-MHC II类复合物（InsB10-23:I-Ag7）的嵌合抗原受体对调节性T细胞进行基因工程改造，可以成功地将Tregs重定向至胰岛抗原，从而在NOD小鼠模型中有效预防自身免疫性糖尿病的发生。
科学价值与应用价值： 1. 概念验证与技术创新： 本研究首次证明了使用肽-MHC II类特异性CAR来武装Tregs以治疗自身免疫疾病的可行性。与之前针对可溶性抗原（如胰岛素）的CAR Tregs研究（疗效有限）相比，该策略靶向APC表面呈递的抗原，更利于Tregs通过细胞接触机制发挥强大的局部抑制作用，这为设计高效的CAR Treg疗法提供了关键思路。 2. 治疗策略的优化： 研究再次证实了抗原特异性Tregs相对于多克隆Tregs的优越性，并提供了通过CAR技术规模化制备抗原特异性Tregs的新路径。CAR技术的模块化特性允许对信号域等进行优化，以调节Tregs的活性和持久性。 3. 转化医学潜力： 尽管靶向小鼠特异性表位，但该研究为开发人类T1D的CAR Treg疗法奠定了原理基础。未来可以针对人类T1D相关的自身抗原肽（如胰岛素、GAD65等）及其对应的HLA II类分子，开发人源化的类似CAR，用于临床治疗。此外，此策略也可推广至其他器官特异性自身免疫病或炎症性疾病。
五、 研究亮点 1. 靶点选择精准： 选择由MHC II类分子呈递的胰岛抗原肽作为靶点，确保CAR Tregs能被抗原呈递细胞激活，从而在免疫反应起始和发生的关键部位（淋巴结和靶组织）发挥功能。 2. 高特异性工具的创制： 成功开发了具有高亲和力和高特异性的“TCR样”单抗1B2，并将其转化为功能性的CAR，实现了对特定肽-MHC复合物的精确识别。 3. 显著的“旁观者抑制”效果： 研究充分证明，被特定抗原激活的CAR Tregs能够高效抑制针对其他胰岛抗原的效应T细胞，这对于应对T1D中多克隆、多抗原特异性的自身免疫攻击至关重要。 4. 强大的体内预防效果： 不仅在可控的适应性转移模型中完全预防疾病，更在复杂的自发性模型中展现出长期保护作用，疗效确凿。 5. 机制探究深入： 研究从体外激活、增殖、抑制分子表达到体内定植、激活状态、对效应细胞数量和功能的抑制、以及病理改善等多个层面，系统地阐明了InsB-G7 CAR Tregs的作用机制。
六、 其他有价值的讨论 研究在讨论部分也提出了一些值得深入探索的方向和思考： * CAR亲和力与功能平衡： 文章讨论了TCR/CAR亲和力与Treg抑制功能之间的复杂关系，并指出未来可通过调整scFv亲和力或CAR信号域来优化疗效。 * CAR下调与持久性： 研究中观察到体内CAR表达的下调，这与CAR T细胞适应持续性激活的现象一致。如何平衡CAR的激活强度与持久表达是需要解决的技术问题。 * 长期耐受诱导： 尽管在自发性模型中长期有效，但输注的CAR Tregs并未被检测到长期存在。这提示可能不需要Tregs的长期定植也能诱导稳定的免疫耐受，但其具体机制有待阐明。 * 临床转化考虑： 作者指出，将此疗法应用于已发病的糖尿病患者（逆转疾病）可能是更贴近临床现实的下一步研究方向，并认为初步数据支持其可行性。同时也需关注治疗的安全性，如工程化细胞潜在的致瘤性或免疫原性风险。
这项研究为1型糖尿病的细胞免疫治疗提供了一种极具前景的新策略，代表了CAR技术从肿瘤治疗向自身免疫病领域拓展的重要进展。