关于多功能pH响应型纳米颗粒用于非小细胞肺癌诊疗一体化的研究报告

一、 研究团队与发表信息

本研究由Chong Qiu, Fei Xia, Qingchao Tu, Huan Tang（并列第一作者）以及Xijun Wang* 和 Jigang Wang*（共同通讯作者）领衔的团队完成。研究团队主要来自中国中医科学院中药研究所、黑龙江中医药大学、河南大学药学院以及深圳市人民医院等多个机构。该研究成果于2025年发表在学术期刊 Molecular Cancer 上，文章标题为《Multimodal lung cancer theranostics via manganese phosphate/quercetin particle》。

二、 学术背景与研究目的

1. 科学领域： 本研究属于纳米医学、肿瘤诊疗一体化（Theranostics）和中药现代化交叉领域，聚焦于开发新型纳米药物递送系统用于癌症的诊断与治疗。

2. 研究背景与动机： 非小细胞肺癌（NSCLC）是全球第二大常见恶性肿瘤和癌症相关死亡的首要原因，其临床诊疗面临严峻挑战。传统诊断方法（如影像学）对早期病灶、转移灶和残留病灶的检测能力有限，导致确诊时往往已到晚期，五年相对生存率仅约19%。传统治疗手段（手术、放疗、化疗）则存在创伤大、副作用强、成本高等问题。更重要的是，临床上的诊断和治疗过程通常是分离的，缺乏能够实时根据病情调整治疗方案的整合策略，这限制了疗效并推高了治疗成本。

中药活性成分因其多靶点、低毒性和高安全性等特点，在抗肿瘤药物开发中展现出巨大潜力。槲皮素（Quercetin, QCT）是一种天然黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗炎等多种生物活性，其抗肿瘤机制涉及通过上调促凋亡蛋白Bax、下调抗凋亡蛋白Bcl-2来诱导细胞凋亡。然而，槲皮素的水溶性差、生物利用度低和靶向能力不足限制了其临床应用。

锰（Mn）作为一种必需微量元素，在肿瘤治疗中也显示出潜力。Mn²⁺不仅能与槲皮素形成稳定复合物，提高其生物利用度，还能在肿瘤细胞内通过类芬顿（Fenton-like）反应催化内源性过氧化氢（H₂O₂）产生高毒性的羟基自由基（·OH），消耗谷胱甘肽（GSH），促进活性氧（ROS）生成，从而诱导铁死亡（Ferroptosis）。此外，Mn²⁺还能激活cGAS-STING信号通路，促进树突状细胞成熟和T细胞浸润，诱导免疫原性细胞死亡（Immunogenic Cell Death, ICD）。同时，Mn²⁺也是一种优良的磁共振成像（MRI）造影剂，可用于肿瘤成像。

3. 研究目的： 基于上述背景，本研究旨在构建一种集诊断与治疗于一体的多功能纳米平台，以解决非小细胞肺癌诊疗分离的难题。具体目标包括： * 治疗方面： 开发一种pH敏感型核壳纳米颗粒，实现槲皮素和Mn²⁺在肿瘤酸性微环境（如溶酶体）中的可控释放，协同诱导肿瘤细胞凋亡和铁死亡，并激活抗肿瘤免疫反应。 * 诊断方面： 利用纳米颗粒在肿瘤部位的靶向富集和Mn²⁺的释放，实现有效的T2加权磁共振成像（T2-weighted MRI）增强，用于肿瘤的精准成像。 * 策略整合： 提出并验证一种“一石二鸟”的诊疗一体化策略，将中药治疗、铁死亡疗法、免疫疗法和影像诊断整合于单一纳米平台。

三、 详细研究流程

本研究包含纳米颗粒的制备与表征、细胞水平机制研究、动物体内药效与安全性评价以及成像功能验证等多个系统性的实验流程。

1. 纳米颗粒的制备与表征 * 研究对象与方法： 研究合成了阿仑膦酸-透明质酸接枝聚合物包覆的槲皮素负载磷酸锰纳米颗粒（Alendronate-Hyaluronic acid graft polymer coated quercetin-loaded manganese phosphate nanoparticles, AHA@MNP/QCT NPs）。合成过程分为三步：(i) 使用N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）活化透明质酸（HA）的羧基，与阿仑膦酸（Alendronate）接枝形成AHA聚合物。(ii) 将MnCl₂与槲皮素（QCT）通过络合反应形成稳定核心。(iii) 在超声条件下，将含有AHA的HEPES缓冲液逐滴加入上述混合物中，AHA中的磷酸基团封装Mn²⁺-QCT复合物，最终形成带负电的AHA@MNP/QCT NPs。通过优化Mn²⁺和AHA的浓度，确定了最佳配方（100 mM Mn²⁺和10 mg/mL AHA）。 * 表征实验： * 形貌与尺寸： 使用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察纳米颗粒的形貌、分散性和尺寸（~120-150 nm）。动态光散射（DLS）测量其水合粒径（~205.60 nm）和多分散指数（PDI，0.20）。 * 成分与结构： 采用能量色散X射线光谱（EDS）确认纳米颗粒表面存在C、O、Mn、P元素。傅里叶变换红外光谱（FTIR）和X射线光电子能谱（XPS）分析证实了AHA、QCT和MNP的成功复合与封装。紫外-可见光谱（UV-Vis）在300 nm处检测到QCT的特征吸收峰，并计算出其负载率为12.3%，包封率为93.2%。 * 稳定性： 评估了纳米颗粒在不同稀释倍数、不同介质（如PBS）中的稳定性，以及在4°C下长期储存（三周）的稳定性，结果表明纳米颗粒具有良好的稀释稳定性和储存稳定性。 * Zeta电位： 测量了各组分及最终纳米颗粒的Zeta电位，AHA@MNP/QCT NPs为-18.6 mV，表明其表面带负电，有利于稳定性和细胞摄取。

2. 细胞摄取与释放机制研究 * 研究对象： 小鼠肺癌Lewis细胞和人非小细胞肺癌A549细胞。 * 实验方法： * 细胞摄取： 使用FITC或Cy5荧光标记的纳米颗粒，通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜定量和定性分析纳米颗粒被肿瘤细胞的摄取情况。通过预先用游离HA处理细胞（竞争性结合CD44受体）来验证HA介导的靶向作用。 * pH响应性释放： 将纳米颗粒置于不同pH（7.4， 6.5， 5.0）的HEPES缓冲液中，观察其溶解现象，并通过SEM观察形貌变化。使用高碘酸钾法和紫外分光光度法分别定量检测不同pH条件下Mn²⁺和QCT的释放曲线。 * 溶酶体逃逸： 使用LysoTracker Green标记溶酶体，Cy5标记纳米颗粒，通过激光共聚焦显微镜观察纳米颗粒进入细胞后与溶酶体的共定位情况随时间的变化，计算共定位系数，以评估其溶酶体逃逸能力。 * 细胞内过程观察： 使用透射电镜（TEM）观察经纳米颗粒处理后的Lewis细胞的超微结构变化。

3. 体外抗肿瘤效应与机制研究 * 研究对象： Lewis细胞和A549细胞。 * 实验方法： * 细胞毒性： 使用CCK-8试剂盒检测不同浓度QCT、AHA@MNP NPs和AHA@MNP/QCT NPs处理48小时后对肿瘤细胞活力的影响。 * 细胞死亡模式： 使用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术和PI/Calcein-AM双染荧光成像检测细胞凋亡情况。通过TEM观察细胞内的凋亡小体和自噬小体。 * 凋亡相关蛋白表达： 使用蛋白质印迹法（Western Blot）检测经不同处理后，肿瘤细胞中Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3等凋亡相关蛋白的表达水平。 * 转录组学分析： 对经PBS（对照）、AHA@MNP NPs和AHA@MNP/QCT NPs处理的Lewis细胞进行RNA测序，分析差异表达基因（DEGs），并进行基因集富集分析（GSEA），以探索纳米颗粒作用的全局性分子通路。 * 铁死亡相关机制验证： * 体外类芬顿反应： 在含有H₂O₂的PBS溶液中加入纳米颗粒，观察氧气气泡生成，并使用过氧化氢检测试剂盒定量H₂O₂的分解。使用亚甲基蓝（MB）降解实验验证·OH的生成。 * 细胞内氧化应激： 使用商业试剂盒检测纳米颗粒处理后，细胞内H₂O₂水平和氧化型谷胱甘肽（GSSG）水平的变化。 * 活性氧（ROS）检测： 使用DCFH-DA荧光探针，通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测纳米颗粒处理后细胞内ROS的水平。 * 脂质过氧化检测： 使用Bodipy ⁵⁸¹⁄₅₉₁ C11荧光探针和Western Blot检测脂质过氧化产物（LPO），以证实铁死亡的发生。 * 细胞器损伤： 通过TEM观察纳米颗粒处理后，线粒体和内质网的形态变化（如空泡化、破裂）。 * 免疫原性细胞死亡（ICD）机制验证： * cGAS-STING通路激活： 使用Western Blot检测树突状细胞中cGAS、STING及磷酸化STING（p-STING）蛋白的表达。 * 损伤相关分子模式（DAMP）释放： 使用商业试剂盒检测细胞培养上清中ATP和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的释放水平。使用免疫荧光检测细胞表面钙网蛋白（CRT）的表达。

4. 体内抗肿瘤药效与生物安全性评价 * 研究对象： 建立Lewis肺癌荷瘤的C57BL/6小鼠模型（每组n=5）。 * 实验流程： * 分组与给药： 待肿瘤体积达到约100 mm³时，将小鼠随机分为三组：生理盐水组、AHA@MNP NPs组、AHA@MNP/QCT NPs组。通过尾静脉注射相应药物或生理盐水。 * 疗效评估： 每两天记录一次小鼠的肿瘤体积、体重和生存状态。治疗结束后处死小鼠，剥离肿瘤并称重，计算肿瘤生长抑制率（TGI）。 * 肿瘤免疫微环境分析： 取肿瘤组织切片，通过免疫荧光染色检测肿瘤组织中树突状细胞（CD11c⁺）、辅助性T细胞（CD4⁺）、细胞毒性T细胞（CD8⁺）、调节性T细胞（Foxp3⁺）以及M1型（CD80⁺）和M2型（CD206⁺）巨噬细胞的浸润情况，并使用ImageJ进行荧光强度定量分析。 * 生物安全性评估： * 体外溶血实验： 检测纳米材料对红细胞的溶血率。 * 细胞毒性： 检测纳米材料对小鼠成纤维细胞（L929）的毒性。 * 体内毒性： 监测小鼠体重变化和生存率。 * 组织病理学： 对心、肝、脾、肺、肾等主要器官进行H&E染色，观察有无病理损伤或肿瘤转移。 * 血液学与血生化： 进行全血细胞计数和血液生化指标检测，评估对造血系统和肝肾功能的影响。

5. 非侵入性成像功能验证 * 研究对象： Lewis肺癌荷瘤的C57BL/6小鼠。 * 实验方法： * 体内分布与靶向性： 将纳米颗粒用近红外荧光染料Cy7标记，通过尾静脉注射给荷瘤小鼠。使用活体荧光成像系统（IVIS）在注射后不同时间点（0， 6， 12， 24， 48小时）观察纳米颗粒在体内的分布和肿瘤部位的富集情况。48小时后处死小鼠，取出主要器官和肿瘤进行离体荧光成像。 * 体外MRI性能： 将纳米颗粒置于不同pH（7.4， 6.5， 5.0）的缓冲液中不同时间，或与不同浓度的缓冲液混合，使用MRI扫描仪获取T2加权图像，并量化信号强度，评估其pH响应性和浓度依赖性。 * 体内MRI成像： 给荷瘤小鼠尾静脉注射纳米颗粒，在注射后不同时间点（0， 0.5， 1， 2， 4， 8小时）或注射不同浓度纳米颗粒1小时后，进行MRI扫描，观察肿瘤部位T2信号的变化，评估其作为MRI造影剂的成像效果。

四、 主要研究结果

1. 纳米颗粒成功构建并具备理想特性： 成功合成了单分散、球形、尺寸均一的AHA@MNP/QCT NPs。表征数据证实了AHA、QCT和MNP的成功复合。纳米颗粒在生理pH下稳定，在酸性pH下快速崩解释放Mn²⁺和QCT，表现出良好的pH响应性。

2. 高效的CD44介导的靶向摄取与溶酶体逃逸： 流式细胞术和共聚焦显微镜结果显示，AHA@MNP/QCT NPs凭借其表面的HA与肿瘤细胞高表达的CD44受体结合，被细胞高效摄取，摄取量显著高于无HA包被的对照组。预先用游离HA处理可竞争性抑制其摄取，证实了CD44介导的靶向机制。共定位实验表明，纳米颗粒进入细胞后定位于溶酶体，并在酸性环境下快速溶解，导致溶酶体渗透压升高而破裂，实现了高效的溶酶体逃逸和胞内药物释放。TEM图像也观察到了细胞内纳米颗粒的积累和细胞边缘的粗糙化。

3. 强大的体外抗肿瘤活性： CCK-8实验表明，AHA@MNP/QCT NPs对Lewis和A549细胞具有浓度依赖性的杀伤作用，其效果显著优于游离QCT和单独的AHA@MNP NPs。流式细胞术和荧光成像证实该纳米颗粒能显著诱导肿瘤细胞凋亡。Western Blot结果显示，其能上调促凋亡蛋白Bax，下调抗凋亡蛋白Bcl-2和失活的Caspase-3，表明通过线粒体途径诱导凋亡。TEM观察到了凋亡小体和自噬小体的形成。

4. 多途径协同的抗肿瘤药效机制： * 转录组学揭示全局效应： RNA-seq分析发现，与对照组相比，AHA@MNP/QCT NPs处理组的上调基因富集于免疫效应过程、TNF产生、凋亡信号通路和ROS反应等；下调基因则与糖酵解、上皮细胞分化、ATP代谢等过程相关。GSEA分析证实了TNF信号通路、坏死性凋亡和凋亡通路的上调。 * 诱导铁死亡： 体外实验证实纳米颗粒能高效分解H₂O₂并产生·OH。细胞实验显示，纳米颗粒处理能显著降低细胞内H₂O₂水平，升高GSSG水平，并大幅提升ROS水平。Bodipy探针和Western Blot证实了脂质过氧化的发生。TEM观察到线粒体空泡化、嵴消失以及内质网断裂，这些均是铁死亡的典型形态学特征。这些结果串联起来表明：纳米颗粒在酸性溶酶体中释放Mn²⁺，Mn²⁺通过类芬顿反应将肿瘤细胞内高水平的H₂O₂转化为有毒的·OH，消耗抗氧化剂GSH，导致ROS（特别是·OH）在线粒体和内质网中过量积累，引发脂质过氧化，最终导致铁死亡。 * 诱导免疫原性细胞死亡（ICD）： Western Blot显示纳米颗粒处理能上调树突状细胞中cGAS和p-STING/STING的表达，表明激活了cGAS-STING通路。同时，检测到肿瘤细胞释放ATP和HMGB1增加，细胞表面CRT表达上调，这三个都是关键的ICD相关分子模式（DAMPs）。这为后续激活抗肿瘤免疫提供了基础。

5. 显著的体内抗肿瘤效果与免疫激活： 在Lewis肺癌荷瘤小鼠模型中，AHA@MNP/QCT NPs治疗组显示出最强的肿瘤生长抑制效果，肿瘤体积和重量显著减小，小鼠生存期延长。免疫荧光分析显示，治疗组肿瘤组织中CD11c⁺树突状细胞、CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞的浸润显著增加，而Foxp3⁺ Treg细胞减少。同时，肿瘤组织中M1型巨噬细胞（CD80⁺）增多，M2型巨噬细胞（CD206⁺）减少，表明纳米颗粒能重塑肿瘤免疫微环境，使其从免疫抑制状态向免疫激活状态转变。这验证了其通过释放Mn²⁺激活cGAS-STING通路，进而促进免疫细胞浸润和功能活化的机制。

6. 良好的生物相容性： 体外溶血率低于5%，对正常成纤维细胞毒性低。体内实验显示，治疗组小鼠体重稳定，无死亡事件。H&E染色显示主要器官无明显病理损伤，且AHA@MNP/QCT NPs组小鼠的肺和肝中未见明显肿瘤转移灶，提示其可能具有抑制转移的潜力。血液学和血生化指标均在正常范围内。

7. 优异的肿瘤靶向与MRI成像能力： 活体荧光成像显示，Cy7标记的AHA@MNP/QCT NPs能高效靶向并富集于肿瘤部位，且在48小时仍保持较高信号，而无HA包被的对照组靶向性差。离体器官成像进一步证实其在肿瘤和肝脏（网状内皮系统摄取）有较高蓄积。体外MRI实验表明，纳米颗粒在酸性条件下（pH 5.0）能快速释放Mn²⁺，导致T2信号显著减弱（变暗），而在生理pH下信号稳定。体内MRI成像显示，注射纳米颗粒后，肿瘤区域T2信号随时间先显著减弱（1小时最强），后逐渐恢复，这与纳米颗粒在肿瘤部位