2024年8月，由Abraham L. Bayer、Maria A. Zambrano、Sasha Smolgovsky、Zachary L. Robbe、Abul Ariza、Kuljeet Kaur、Machlan Sawden、Anne Avery、Cheryl London、Aarti Asnani和Pilar Alcaide等研究人员组成的团队，在《Nature Cardiovascular Research》期刊（第3卷，2024年8月，第970–986页）上发表了一篇原创性研究论文，题目为《Cytotoxic T cells drive doxorubicin-induced cardiac fibrosis and systolic dysfunction》。这项研究聚焦于肿瘤心脏病学与免疫学交叉领域，旨在揭示化疗药物阿霉素（Doxorubicin, DR）导致心脏毒性及心力衰竭的具体免疫学机制。阿霉素作为最常用的化疗药物之一，其剂量依赖性的心脏毒性是临床面临的严重挑战。尽管已知全身性炎症与阿霉素诱导的心肌病相关，但其背后具体的免疫机制，特别是适应性免疫系统的作用，尚不明确。因此，本研究的目标是阐明阿霉素治疗引发的免疫应答，特别是细胞毒性T细胞（CD8+ T细胞）在驱动心脏纤维化和收缩功能障碍中的核心作用。
阿霉素是一种广泛用于治疗实体瘤和血液系统恶性肿瘤的蒽环类化疗药物。其作用机制主要是通过抑制拓扑异构酶II来杀死快速分裂的癌细胞。然而，它同时会在心肌细胞中产生活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS），导致直接的心肌损伤并引发促炎反应。尽管先前的研究已观察到阿霉素治疗后的心脏中存在炎症细胞浸润和细胞因子水平升高，但这些研究主要集中于先天免疫系统。在多种心力衰竭模型中，T细胞（包括CD4+和CD8+ T细胞）已被证明参与病理过程，例如心肌炎、缺血性和非缺血性心力衰竭。然而，在阿霉素诱导的心肌病中，T细胞是否以及如何发挥作用尚不清楚。此外，CD8+ T细胞是抗肿瘤免疫的关键效应细胞，主要通过脱颗粒释放颗粒酶（Granzyme）等方式杀伤靶细胞。因此，一个核心的科学问题是：在阿霉素治疗中，CD8+ T细胞是否扮演了“双刃剑”的角色——一方面攻击肿瘤，另一方面却对心脏产生脱靶毒性？本研究正是为了回答这个问题，并深入探索其分子机制。
本研究是一项综合性的转化医学研究，整合了临床前小鼠模型、体外细胞实验以及对犬类和人类患者的临床样本分析。整个工作流程设计严谨，层层递进，从现象观察到机制探索，再到临床验证。
第一部分：临床前小鼠模型建立与表型观察 研究首先在野生型（WT）C57BL/6J小鼠中建立了阿霉素诱导的心肌病模型。实验组小鼠每周腹腔注射一次阿霉素（5 mg/kg），持续4周或8周，对照组注射磷酸盐缓冲液（PBS）。研究的主要流程和检测手段包括： 1. 心脏功能评估：使用高频超声心动图测量射血分数（Ejection Fraction, EF）和心室壁厚度，评估心脏收缩功能和结构变化。 2. 心脏组织病理学分析：在实验终点收集心脏组织，进行多项分析：a) 通过流式细胞术（Flow Cytometry）定量心脏中浸润的免疫细胞（如CD8+、CD4+ T细胞、单核细胞、中性粒细胞）的数量和亚型。b) 通过免疫组织化学染色（Immunohistochemistry, IHC）直接观察CD8+ T细胞在心肌内的定位。c) 通过TUNEL染色检测心肌细胞凋亡。d) 通过天狼星红（Picrosirius Red, PSR）染色评估心脏间质和血管周围纤维化程度。e) 通过蛋白质印迹法（Western Blot）和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测纤维化相关蛋白（如胶原蛋白I、III）和炎症因子（如CXCL9, CXCL10）的表达水平。f) 通过实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测相关基因（如Ifng, Cxcl9, Cxcl10）的转录水平。 3. 系统免疫应答评估：收集外周血和次级淋巴器官（如脾脏、纵隔淋巴结Mediastinal Lymph Node, MLN），通过流式细胞术分析循环T细胞和淋巴组织中T细胞的活化状态、效应功能（如IFN-γ产生、脱颗粒标志物CD107a表达、颗粒酶B表达）以及耗竭标记物（如PD-1, CTLA-4）。
第二部分：功能验证实验 在观察到阿霉素显著诱导心脏CD8+ T细胞浸润和活化后，研究通过功能缺失和获得性实验来验证其因果作用。 1. 抗体清除实验：在开始阿霉素治疗前，使用抗CD8或抗CD4单克隆抗体清除小鼠体内的相应T细胞亚群。随后评估清除特定T细胞亚群对心脏功能、纤维化和心肌损伤的影响。 2. 基因缺陷小鼠模型：使用缺乏所有T细胞的Tcra-/-小鼠，对比其与野生型小鼠对阿霉素心脏毒性的易感性差异，进一步确认T细胞的整体作用。 3. 过继性T细胞转移实验：为了特异性证明特定T细胞亚型的作用，研究团队从野生型小鼠脾脏中分离并体外活化CD8+ T细胞，使其分化为I型细胞毒性T细胞（Tc1），然后将这些活化的Tc1细胞过继转移到已开始阿霉素治疗的Tcra-/-小鼠体内，观察其对心脏功能的“挽救”效应。
第三部分：抗原依赖性与细胞间相互作用的机制探索 为了深入阐明CD8+ T细胞被激活并靶向心脏的机制，研究进行了以下实验： 1. 抗原特异性模型：使用卵清蛋白（OVA）肽段特异性T细胞受体转基因小鼠（OT-I小鼠）。通过比较未经免疫的OT-I小鼠（其CD8+ T细胞无法识别内源性抗原）与经OVA肽段免疫的OT-I小鼠（人为激活其CD8+ T细胞）在接受阿霉素治疗后的心脏表型，来探究CD8+ T细胞反应是否是抗原依赖性的。 2. 心脏成纤维细胞与T细胞的相互作用研究：这是本研究的核心机制探索部分。a) 体外共培养：从小鼠心脏分离原代心脏成纤维细胞（Cardiac Fibroblasts, CFB），用阿霉素预处理后，与活化的Tc1细胞共培养。通过免疫荧光显微镜观察T细胞在成纤维细胞上的粘附情况，以及成纤维细胞向肌成纤维细胞转化（表达α-平滑肌肌动蛋白αSMA）的情况。b) 粘附分子机制：使用针对LFA-1和VLA-4的阻断抗体，探究T细胞-成纤维细胞粘附的分子基础。c) 脱颗粒与纤维化介导：在共培养体系中，通过流式细胞术检测Tc1细胞表面CD107a的表达，评估其脱颗粒水平。同时，使用重组颗粒酶B直接处理心脏成纤维细胞，观察其是否足以诱导αSMA和胶原蛋白的表达。
第四部分：跨物种临床相关性验证 为了将小鼠模型中的发现转化到临床，研究分析了两个患者队列： 1. 犬淋巴瘤患者：分析了36只接受阿霉素治疗的犬淋巴瘤患者在治疗前、治疗后1个月和4个月的外周血T细胞计数。 2. 人类血液系统恶性肿瘤患者：分析了5名患者在接受以阿霉素为基础的化疗前和开始治疗3个月后的外周血样本，通过流式细胞术详细表征了CD8+ T细胞的表型（IFN-γ, CXCR3, 颗粒酶B表达）。此外，还利用了团队先前发表的数据集，分析了患者血浆中CXCL9和CXCL10的水平，并与超声心动图测量的射血分数变化进行相关性分析。
数据分析工作流程：所有数据均使用标准统计软件进行分析（如GraphPad Prism）。组间比较根据数据特点采用t检验、单因素或双因素方差分析（ANOVA）并进行事后多重比较。相关性分析采用Pearson相关。所有实验均设置了适当的对照组，数据分析人员对实验分组采用盲法。
本研究取得了一系列连贯且相互印证的重要发现，逐步揭示了CD8+ T细胞在阿霉素心脏毒性中的中心地位。
结果一：阿霉素诱导全身及心脏特异性的CD8+ T细胞免疫应答。 在小鼠模型中，阿霉素治疗4周和8周后，心脏内CD8+ T细胞的频率和绝对数量均显著增加，而CD4+ T细胞无明显变化。免疫组化证实了CD8+ T细胞在心肌内的浸润。与此同时，小鼠出现了射血分数下降、心室壁变薄、心脏萎缩和心肌细胞凋亡增加等典型的心脏毒性表型。在系统层面，外周血中CD8+ T细胞比例升高，血清中多种促炎细胞因子和趋化因子（包括IFN-γ、CXCL9、CXCL10）水平也显著上升。在纵隔淋巴结和脾脏中，阿霉素处理组小鼠的效应型CD8+ T细胞（CD62LloCD44hi）比例增加，并且这些细胞高表达T-bet和IFN-γ，表明其分化为I型细胞毒性T细胞（Tc1）。这些结果首次系统性地描绘了阿霉素诱导的以CD8+ Tc1细胞为主导的适应性免疫应答图谱。
结果二：CD8+ T细胞是驱动心脏纤维化和收缩功能障碍的关键致病因素，而CD4+ T细胞（调节性T细胞）起保护作用。 功能验证实验提供了确凿证据。通过抗体清除CD8+ T细胞，小鼠被完全保护，避免了阿霉素引起的射血分数下降、心室壁变薄、以及心脏间质和血管周围的纤维化。相反，清除CD4+ T细胞不仅没有保护作用，反而有加重心脏功能障碍和增加CD8+效应T细胞的趋势。进一步分析发现，阿霉素治疗增加了淋巴结中Foxp3+ Helios+的调节性T细胞（T-regs），这解释了CD4+ T细胞的保护性作用——它们可能负向调控CD8+ T细胞的活化。Tcra-/-小鼠（缺乏所有T细胞）在阿霉素治疗后表现出部分的心脏保护作用，其射血分数下降和纤维化程度均显著轻于野生型小鼠，但仍有部分心肌损伤和纤维化，提示阿霉素对心肌细胞和成纤维细胞有直接的、不依赖于T细胞的毒性作用。
结果三：CD8+ T细胞的活化是抗原依赖性的，并需要阿霉素诱导的心脏损伤共同作用。 使用OT-I小鼠的实验结果至关重要。未经免疫的OT-I小鼠（其CD8+ T细胞无法识别内源性抗原）在接受阿霉素治疗后，完全未出现心脏功能衰竭和纤维化。然而，如果通过OVA肽段免疫人为激活其CD8+ T细胞，则阿霉素的心脏毒性表型（包括心功能下降、T细胞心脏浸润和纤维化）得以“重现”。这一精巧的实验设计证明，阿霉素心脏毒性的发生需要两个条件：一是CD8+ T细胞被内源性新抗原（neoantigens）激活，二是阿霉素造成的心脏损伤环境。
结果四：阿霉素通过上调心脏成纤维细胞的ICAM-1表达，促进其与CD8+ T细胞的相互作用，从而双向驱动纤维化和T细胞脱颗粒。 这是本研究揭示的核心分子机制。体外实验发现，阿霉素直接处理心脏成纤维细胞，可剂量依赖性地诱导其表达粘附分子ICAM-1（细胞间粘附分子-1），而非VCAM-1（血管细胞粘附分子-1）。当活化的Tc1细胞与阿霉素预处理过的成纤维细胞共培养时，T细胞的粘附显著增强，并导致成纤维细胞向高表达αSMA的肌成纤维细胞转化。这种相互作用依赖于LFA-1/ICAM-1通路，因为阻断LFA-1（而非VLA-4）可同时抑制T细胞粘附和成纤维细胞转化。更有趣的是，这种细胞接触是双向的：它不仅激活了成纤维细胞，还触发了Tc1细胞的脱颗粒（表面CD107a表达增加）。脱颗粒释放的颗粒酶B被发现可以直接作用于成纤维细胞，以剂量依赖的方式诱导其表达αSMA、胶原蛋白I和III，从而成为连接T细胞毒性与纤维化的直接分子桥梁。
结果五：临床患者样本证实了跨物种的CD8+ T细胞免疫应答。 在犬和人类患者中的分析结果与小鼠模型高度一致。接受阿霉素治疗的犬淋巴瘤患者，其外周血CD8+ T细胞数量在治疗后1个月和4个月均持续升高，而CD4+ T细胞无显著变化。在接受蒽环类化疗的人类患者中，治疗后3个月，循环中IFN-γ+ CD8+ T细胞和表达CXCR3（CXCL9/10的受体）的CD8+ T细胞比例显著增加。更重要的是，对已有临床数据的分析发现，患者血浆中CXCL9和CXCL10的水平与化疗后射血分数的下降呈显著负相关，这为将CXCL9/10/CXCR3轴作为阿霉素心脏毒性的潜在生物标志物或治疗靶点提供了初步临床依据。
本研究得出明确结论：阿霉素会引发一种由内源性抗原驱动的、IFN-γ阳性的CD8+ 细胞毒性T细胞免疫应答。这些活化的CD8+ T细胞浸润心脏，通过与阿霉素预处理的、高表达ICAM-1的心脏成纤维细胞相互作用，发生接触依赖性脱颗粒，释放颗粒酶B。这一过程不仅直接加剧了成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化和胶原沉积（导致纤维化），还通过尚未完全阐明的机制损害心肌细胞功能，最终共同导致心脏收缩功能障碍。而CD4+ 调节性T细胞在此过程中起到限制CD8+ T细胞过度活化的保护性作用。
科学价值：本研究首次系统、深入地阐明了适应性免疫，特别是CD8+ T细胞，在化疗药物诱导的心脏毒性中的核心致病作用。它将心脏纤维化、炎症和细胞毒性这三个心力衰竭的关键病理过程通过“成纤维细胞- T细胞相互作用轴”和“颗粒酶B”这一效应分子有机地联系起来，提供了全新的机制视角。研究跨越了小鼠、犬、人类三个物种，证据链完整，具有很强的转化医学说服力。
应用价值：该研究为预防和治疗阿霉素心脏毒性开辟了新的潜在途径。靶向CD8+ T细胞活化的上游通路（如cGAS-STING通路）、阻断CXCL9/10/CXCR3趋化轴以阻止T细胞心脏归巢、中和颗粒酶B的活性、或增强调节性T细胞的功能，都可能成为未来保护心脏的新策略。同时，循环中IFN-γ+ CXCR3+ CD8+ T细胞或血浆CXCL9/10水平有望发展为预测阿霉素心脏毒性的早期生物标志物。
本研究也指出了重要的局限性及未来方向：例如，尚不清楚驱动CD8+ T细胞活化的具体内源性抗原是什么；T细胞与心肌细胞是否直接相互作用；长期停止阿霉素治疗后炎症是否持续；以及如何在不削弱抗肿瘤免疫的前提下选择性抑制心脏的毒性T细胞反应（即区分抗肿瘤与致心脏毒性的T细胞克隆）。这些问题的探索将是未来研究的关键，也将决定基于本研究发现的新疗法能否成功应用于临床，在抗击癌症的同时守护患者的心脏。