该文档发表于*Journal of Controlled Release*期刊2022年9月刊的第350卷，页码为525-537页。本研究的主要作者为孙瑞（Rui Sun）、马雯（Wen Ma）、凌名健（Mingjian Ling）等人，通讯作者为唐龙光（Longguang Tang）、余志强（Zhiqiang Yu）和彭振维（Zhenwei Peng）。作者单位包括南方医科大学药学院及广东省新药筛选重点实验室、南方医科大学附属东莞医院东莞临床癌症研究所实验室医学科、浙江大学医学院第四附属医院国际医学研究所、中山大学第一附属医院放射肿瘤科以及东南大学医学院中大医院江苏省分子与功能影像重点实验室放射科。
本研究属于生物医学工程与纳米医学交叉领域，专注于开发用于癌症诊疗（Theranostics）的新型智能纳米平台。研究的核心目标是克服肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）治疗中存在的耐药性问题并提升精准治疗能力。研究的学术背景基于以下几点：首先，光动力疗法（Photodynamic Therapy， PDT）作为一种微创治疗手段，尽管有副作用小、不易产生耐药性等优点，但其临床转化仍面临诸多挑战。这些挑战包括：大多数已报道的光敏剂激发波长位于可见光区，组织穿透深度有限，且其荧光成像功能在肿瘤组织和正常器官间缺乏选择性；此外，肿瘤细胞内高浓度的谷胱甘肽（Glutathione， GSH）具有抗氧化作用，会削弱PDT的治疗效果，导致单一PDT疗法效果有限。其次，铁死亡（Ferroptosis）作为一种铁依赖性的新型程序性细胞死亡方式，通过消耗GSH和产生活性氧（如羟基自由基）破坏细胞膜结构，为肿瘤治疗提供了新思路。然而，传统的铁死亡疗法往往只是与其它疗法的简单叠加，缺乏选择性和智能响应性，过量铁离子的积累可能对正常器官造成潜在副作用。再者，肝癌是全球第二大癌症致死病因，其中HCC占90%以上，化疗耐药性强，亟需探索新的治疗策略。基于此，本研究旨在构建一种能够在肿瘤微环境酸性pH下被激活的、具备“关/开”（”off/on”）功能的纳米平台。该平台需整合多模态成像（近红外二区荧光成像、磁共振成像、光声成像）和协同疗法（光动力疗法与铁死亡），以实现对HCC的精准诊断和高效协同治疗。
研究的工作流程详细而系统，主要包含以下环节： 第一，新型光敏剂SR780的合成与表征。 研究人员首先设计并合成了一种新型的两亲性克罗康宁（Croconaine）染料衍生物光敏剂SR780。对其进行了全面的表征，包括核磁共振氢谱/碳谱、液相色谱-质谱联用确认结构。性能测试显示，SR780的最大紫外吸收在780 nm，在808 nm激光激发下具有良好的光稳定性（优于对照染料吲哚菁绿ICG和IR780）。关键发现是，SR780表现出pH响应的近红外二区（NIR-II）荧光特性，即酸性条件下荧光信号更强，同时具备良好的光声成像功能和较高的荧光量子产率。更重要的是，当向SR780溶液中添加Fe3+时，其紫外吸收、荧光和PDT效应均显著减弱或消失，形成“关闭”状态；而在酸性条件下，这些特性得以恢复，形成“开启”状态。这表明SR780能与Fe3+配位形成SR780@Fe复合物，该配位键可在酸性环境下断裂，释放出SR780和Fe3+。这一现象构成了后续纳米平台设计的核心基础。
第二，pH响应性主动靶向纳米颗粒的制备与表征。 基于上述发现，研究团队构建了智能纳米诊疗平台。具体步骤如下：首先，将SR780与Fe3+配位形成SR780@Fe。然后，利用pH响应性聚合物——羧基功能化的聚（β-氨基酯）-聚乙二醇[poly(beta-amino esters)-poly(ethylene glycol)， PAE10k-PEG5k-COOH]包裹SR780@Fe，得到SR780@Fe-PAE-COOH纳米颗粒。最后，在纳米颗粒表面连接能够靶向HCC细胞表面磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（Glypican-3， GPC-3）受体的多肽gp2633，制得具有主动靶向功能的最终纳米颗粒SR780@Fe-PAE-GP。通过透射电镜和动态光散射对纳米颗粒的形貌、尺寸和多分散性进行表征，结果显示SR780@Fe-PAE-GP颗粒呈均匀球形，平均粒径约为132.4 nm。在酸性（pH 5.5）环境中孵育后，聚合物降解，颗粒形态改变、尺寸减小，证实了其pH响应性。紫外-可见光谱证实药物成功包裹。体外药物释放实验表明，在pH 5.5条件下，8小时内SR780的累积释放量达到约60%，是pH 7.4条件下的约3倍，证明了酸触发释放特性。
第三，体外细胞水平实验验证摄取、协同机制及疗效。 研究选用人肝癌细胞HepG-2作为体外模型。通过流式细胞术和共聚焦显微镜观察细胞对纳米颗粒的摄取，发现SR780@Fe-PAE-GP组由于GPC-3受体介导的主动靶向作用，其细胞摄取效率显著高于非靶向组和受体阻断组，且摄取在4小时达到最佳。在酸性溶酶体环境中，纳米颗粒的“关/开”转换功能得到验证。为阐明PDT与铁死亡的协同机制，研究团队进行了一系列实验：1) 谷胱甘肽消耗：检测发现经SR780@Fe-PAE-GP处理的细胞，其细胞内GSH水平显著下降（高浓度处理组降至空白对照的约45%）。2) 脂质过氧化：同样处理导致细胞内脂质过氧化物水平显著升高（高浓度组接近空白对照的4倍）。3) 蛋白表达：Western Blotting分析显示，SR780@Fe-PAE-GP处理降低了细胞内关键的抗氧化酶——谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的表达。这些结果共同证实了铁死亡途径的激活：Fe3+消耗GSH，并被还原为Fe2+；Fe2+通过芬顿反应产生羟基自由基，导致脂质过氧化，破坏细胞膜；同时，GSH的消耗间接抑制了GPX4，进一步破坏了细胞氧化还原平衡，增强了细胞对氧化应激的敏感性。细胞毒性实验显示，在808 nm激光照射下，SR780@Fe-PAE-GP对HepG-2细胞的半数抑制浓度约为20 μM，显著优于游离SR780和非靶向纳米颗粒组，证明了协同治疗的优越性。活性氧检测和活死细胞染色实验进一步直观地证实了SR780@Fe-PAE-GP在激光照射下能产生大量ROS，并导致广泛的癌细胞死亡，且该杀伤效应在酸性环境下更强。
第四，纳米颗粒的体内多模态成像与生物分布研究。 研究建立了患者来源的肝癌异种移植模型（Patient-derived xenograft model of HCC， PDXHCC），该模型能更好地模拟临床肝癌的特征。将荷瘤小鼠随机分组，通过尾静脉注射不同纳米制剂（SR780@Fe-PAE， SR780@Fe-PAE-GP，以及预先注射靶向多肽进行受体阻断的组别）。随后在不同时间点进行活体成像。NIR-II荧光成像和光声成像结果一致显示：SR780@Fe-PAE-GP组在肿瘤部位具有最强的信号积累，在给药后4小时达到峰值，且信号强度显著高于非靶向组和受体阻断组。离体器官成像进一步证实了纳米颗粒在肿瘤组织的高选择性富集。磁共振成像结果显示，在注射SR780@Fe-PAE-GP后，肿瘤区域的T1加权信号随时间增强，这与Fe3+在酸性肿瘤微环境中释放、从而增强造影效果有关。这些多模态成像数据共同验证了该纳米平台优异的肿瘤靶向性和酸激活成像能力，为确定最佳治疗时间窗提供了依据。
第五，体内抗肿瘤疗效与生物安全性评估。 在PDXHCC模型上进行治疗实验。荷瘤小鼠被分为7组，分别接受PBS、不同纳米制剂（不加激光）、以及不同纳米制剂联合808 nm激光照射（给药后4小时照光）的处理。监测10天内小鼠的体重和肿瘤体积变化。结果表明：1) 所有治疗组小鼠体重均无明显下降，提示治疗副作用小。2) SR780@Fe-PAE-GP + 激光照射组表现出最强的肿瘤抑制效果，肿瘤抑制率高达98.92%，其中两只小鼠的肿瘤完全消失。该组疗效显著优于仅含PDT效应的SR780-PAE + 激光组（抑制率83.96%）和非靶向但含铁的SR780@Fe-PAE + 激光组（抑制率95.25%），凸显了主动靶向与PDT-铁死亡协同治疗的双重优势。3) 治疗结束后，取肿瘤组织进行苏木精-伊红染色和TUNEL凋亡检测，发现SR780@Fe-PAE-GP + 激光组肿瘤组织出现大量空泡、碎片化和核固缩，凋亡信号最强。此外，在开展治疗实验前，研究还在健康昆明小鼠上进行了系统的生物安全性评估。连续14天观察显示，即使在高剂量（1 mM）下，SR780@Fe-PAE-GP也未引起小鼠体重、摄食量、主要器官组织形态学以及血清生化指标（心、肝、肾功能相关）的显著异常，证明了该纳米制剂良好的生物相容性和安全性。
本研究的结论是，成功设计并构建了一种pH激活的、具备“关/开”功能的智能纳米诊疗平台SR780@Fe-PAE-GP。该平台整合了酸激活的NIR-II荧光/光声/MRI多模态成像以及PDT与铁死亡的协同治疗。其核心机制在于：纳米颗粒通过EPR效应和GPC-3受体介导的主动靶向富集于肿瘤；在肿瘤微酸性环境中，聚合物降解，释放SR780@Fe；进一步的酸性条件使SR780与Fe3+解离，恢复SR780的成像与PDT功能，同时释放的Fe3+通过消耗GSH和引发芬顿反应诱导铁死亡，两者协同极大增强了对肿瘤细胞的杀伤力。体内外实验充分验证了其卓越的靶向性、成像能力和抗肿瘤疗效。
本研究具有重要的科学价值和应用前景。其科学价值在于：1) 创新性地将PDT与铁死亡通过智能纳米平台深度整合，阐明了GSH消耗作为连接两种疗法的桥梁，以及酸激活释放对实现精准协同的关键作用，为设计协同治疗策略提供了新范式。2) 开发了多功能一体化的新型光敏剂SR780，其兼具两亲性、良好稳定性、强PDT效应、pH响应性NIR-II荧光/光声成像能力，以及与Fe3+可逆配位的独特性质，拓展了克罗康宁染料在生物医学中的应用。3) 构建了高度智能化的“All-in-One”诊疗纳米系统，实现了诊断（多模态成像）与治疗（协同疗法）的同步与精准控制，推动了诊疗一体化的发展。其应用价值在于为肝癌，特别是耐药性HCC，提供了一种高效、精准、副作用可控的潜在治疗新方案，具有显著的临床转化潜力。
本研究的亮点包括：1) “关/开”式智能响应设计：利用Fe3+配位和pH响应性聚合物实现了对成像和治疗功能的双重精确调控，最大程度降低了对正常组织的潜在影响。2) 多机制协同增效：不仅简单组合两种疗法，而是通过Fe3+介导的GSH消耗，使铁死亡与PDT相互促进，产生“1+1>2”的协同抗肿瘤效果。3) 卓越的体内外疗效：在高度模拟临床的PDXHCC模型中实现了接近完全的肿瘤抑制，疗效数据非常突出。4) 系统的验证体系：从分子、细胞到动物水平，从理化表征、机制探索到疗效安全评估，研究设计严谨、数据充实、逻辑链条完整。
此外，研究中还包含其他有价值的内容，例如使用了PDXHCC模型这一更贴近临床的肿瘤模型来验证疗效，增强了研究结果的临床相关性；在材料合成、表征和纳米制剂制备方面提供了详细的实验方法，具有良好的可重复性；对纳米制剂的生物安全性进行了全面评估，为其未来的临床应用奠定了基础。这项研究是纳米医学领域一项设计精巧、机制深入、结果出色的高水平工作，为癌症的精准协同诊疗提供了创新性的解决方案。