一种生物打印骨膜类器官实现临界尺寸骨缺损的功能性修复

主要作者及机构： 本研究由陆军军医大学西南医院骨科、四川大学等多家单位合作完成。第一作者为Zhengrong Chen、Kui Huang和Ziyang Zhang，通讯作者为Shiwu Dong、Fei Luo和Ce Dou。论文发表于 Bioactive Materials 期刊，于2026年2月11日收稿，2026年5月21日接受，2026年7月14日在线发表。

研究背景与目的： 临界尺寸骨缺损（critical-sized bone defects）是骨科领域最棘手的临床难题之一，常由严重创伤、肿瘤切除或感染引起，即便反复干预仍常发展为骨不连。现有临床策略过度侧重骨移植物和合成替代物的优化，却忽视了骨膜（periosteum）这一关键调控界面。骨膜并非一层被动的膜，而是一个高度特化的器官级调控系统：其外层纤维层提供机械完整性，内层生发层富集骨骼干/祖细胞、成骨祖细胞、成纤维细胞、内皮细胞和血管周细胞，在骨修复过程中充当成骨细胞的主要储库，同时驱动新生血管长入缺损区，精密协调成骨与血管生成的耦合过程。然而在病理条件下，骨膜常被破坏或切除，这种复杂的调控界面在移植物植入后也很少得到重建，导致细胞归巢受损、血管化不足、重塑失调，最终造成临界尺寸骨缺损修复的高失败率。现有的骨膜仿生策略——包括脱细胞骨膜细胞外基质支架、基于成骨或间充质干细胞的细胞片工程、整合成骨与内皮组分的双层结构，以及负载BMP-2或VEGF等生长因子的微结构膜——虽然在细胞黏附、早期成骨和部分血管化方面有所改善，但它们在本质上受限于静态设计逻辑：将骨膜视为预定义的结构模板或外源信号的储存库，而非一个活的调控系统。这些构建体缺乏天然骨膜所具有的细胞自组织、动态重塑和内源信号整合能力。因此，本研究旨在建立一种基于类器官（organoid）的方法，通过构建功能性骨膜类器官来恢复骨膜身份和调控功能，实现从“制作骨膜样材料”向“工程化骨膜样活体系统”的范式转变。

研究流程与详细方法： 本研究的工作流程可分为六个主要环节。第一环节是生物墨水的合成与理化表征。 研究者首先将明胶和丝素蛋白分别甲基丙烯酰化，获得可光交联的GelMA和SilMA。核磁共振氢谱（¹H NMR）证实两种聚合物均成功引入甲基丙烯酸酯基团，傅里叶变换红外光谱（FTIR）进一步验证了功能化过程未破坏丝素蛋白的二级结构。随后将GelMA与SilMA混合以整合明胶的高细胞黏附性和丝素蛋白的优越黏弹性，再加入黑磷（black phosphorus, BP）纳米片，制成Gel/SilMA + BP复合生物墨水。该复合墨水可高保真地打印成薄膜状构建体，且对塑料、木材、玻璃、金属和生物组织等多种基底表现出强黏附性。扫描电子显微镜（SEM）显示Gel/SilMA和Gel/SilMA + BP支架具有更为精细且互连的多孔结构；能谱分析（EDS）和元素分布图证实了BP在凝胶基质中的均匀分布。力学测试表明SilMA的引入显著提升了水凝胶的拉伸强度、杨氏模量和断裂伸长率；溶胀和降解实验显示Gel/SilMA + BP在28天内保持了更持久的结构完整性。第二环节是二维条件下的体外生物学评价。 将骨髓间充质干细胞（BMSCs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分别与水凝胶共培养。CCK-8实验表明三种水凝胶均支持细胞持续存活，无显著细胞毒性。碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红S（ARS）染色证明Gel/SilMA + BP显著增强了BMSCs的成骨分化和矿化结节形成；qRT-PCR显示Runx2、Osx、ALP、Col1a1和OCN等成骨相关基因在Gel/SilMA + BP组显著上调。在血管生成方面，划痕实验和管形成实验证明Gel/SilMA + BP显著加速了内皮细胞迁移，诱导形成更广泛连续的毛细血管样网络，VEGF表达也显著升高。第三环节是转录组学分析。 将Gel/SilMA + BP水凝胶分别与BMSCs和HUVECs共培养7天后进行RNA测序。BMSC转录组鉴定出1086个差异表达基因（689个上调、497个下调），上调基因富集于细胞外基质组织、骨化、骨矿化、骨骼系统发育、血管生成等生物过程；KEGG通路分析显示PI3K-Akt信号级联和ECM-受体相互作用/整合素信号通路的显著富集；Western blot验证了PI3K和Akt磷酸化增强以及Runx2和IBSP蛋白表达上调。HUVEC转录组鉴定出305个差异表达基因，富集于血管形态发生、血管生成、趋化性和细胞间黏附调控等过程，KEGG分析突出显示了细胞因子-细胞因子受体相互作用和趋化因子信号通路的富集。第四环节是三维培养体系的构建与评价。 将大鼠BMSCs和大鼠内皮祖细胞（EPCs）以1:1比例（总密度2×10⁶ cells/ml）负载于生物墨水中，通过挤出式3D生物打印机（挤出压力70 kPa，打印速度15 mm/s，25G针头，层高0.2 mm，共4层）打印成膜状构建体，经405 nm光交联30秒成型。在三维培养中，GelMA构建体在第21天出现明显收缩和部分塌陷，而Gel/SilMA和Gel/SilMA + BP保持了规则的几何形态。活/死染色显示三组细胞存活率均超过80%；细胞骨架染色显示Gel/SilMA + BP组细胞铺展最为广泛，形成桥状F-actin网络。第7天ALP染色和第21天ARS染色均显示Gel/SilMA + BP组具有最高的成骨活性和最丰富的矿化结节。第21天免疫荧光显示Osx和VEGF-A在Gel/SilMA + BP组表达显著升高，表明成骨祖细胞富集和促血管生成微环境的建立。第五环节是体内成熟评价。 将体外培养3天的细胞负载构建体植入裸鼠皮下，于15天和30天取材。大体观察显示Gel/SilMA + BP类器官在第15天即表现出更均匀的组织覆盖，第30天保持了结构完整性并出现表面微血管样结构。SEM显示该组在第30天形成了更厚、更连续且高度互连的纤维束，并可见多种细胞形态（盘状、圆形和卵圆形）。Masson三色染色显示第30天Gel/SilMA + BP类器官形成了致密连续的胶原纤维网络。免疫荧光显示骨膜蛋白（periostin）在Gel/SilMA + BP组表达最强且最连续，骨钙素（OCN）阳性成骨谱系细胞显著富集；CD31/α-SMA双染色显示该组形成了更多连续性CD31阳性管腔结构，且到第30天出现了α-SMA阳性血管周细胞覆盖，指示血管稳定化。第六环节是临界尺寸骨缺损修复评价。 在大鼠颅骨建立直径5 mm的临界尺寸缺损模型，分为空白对照组、GelMA组、Gel/SilMA组和Gel/SilMA + BP组。术后4周和8周进行Micro-CT扫描和定量分析，Gel/SilMA + BP组获得了最高的骨体积分数（BV/TV）和骨密度（BMD），骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）也显著增加，骨小梁分离度（Tb.Sp）降低。组织学染色显示该组在第4周即出现明显的编织骨和连续富胶原基质，第8周形成了致密有序的胶原纤维，新生骨从缺损边缘向中心显著桥接。免疫荧光证实该组骨膜蛋白表达最强且与邻近天然骨膜无缝整合，OCN荧光强度显著高于其他组，CD31/α-SMA信号显著升高。TRAP染色显示该组破骨细胞阳性面积显著减少，提示骨重塑的再平衡。此外，术后7天血液炎症标志物（IL-6、TNF-α、IL-1β、CRP）在各组间无显著差异，肝、肾组织磷含量无显著差异，8周时主要器官未检出病理异常，表明该体系具有良好的体内生物安全性。

主要结果与数据支撑： 在二维体系中，Gel/SilMA + BP组的ALP活性显著高于对照（n=7，P<0.001），14天ARS染色矿化结节明显增多（n=7，P<0.001），成骨基因Runx2、Osx、ALP、Col1a1、OCN的mRNA水平均显著上调（n=3，P<0.01或P<0.001）。管形成实验中Gel/SilMA + BP组的网格数和总管长显著增加（n=6，P<0.001）。转录组数据中，BMSCs在Gel/SilMA + BP处理后PI3K-Akt通路和ECM-受体相互作用通路显著正富集，HUVECs的血管生成和内皮发育基因集显著正富集。三维培养中，第7天Gel/SilMA + BP组ALP活性最高（n=5，P<0.001），第21天钙沉积最丰富（n=5，P<0.001），Osx和VEGF-A荧光强度最高（n=5，P<0.001）。体内成熟实验中，第30天periostin和OCN荧光定量均显著高于其他组（n=5，P<0.001），CD31荧光强度显著升高（n=5，P<0.001）。大鼠颅骨缺损模型中，第8周Gel/SilMA + BP组BV/TV和BMD在所有组中最高（n=6，P<0.001），Tb.N和Tb.Th也显著增加（n=6，P<0.05或P<0.01）；periostin、OCN、CD31和α-SMA荧光定量均显著升高（n=5，P<0.001）；TRAP阳性面积显著减少（n=3，P<0.001）。

结论与意义： 本研究建立了骨膜类器官作为一种活的再生界面，能够恢复临界尺寸骨缺损中的骨膜身份和调控功能。通过将生物活性的GelMA/SilMA互穿复合网络水凝胶与黑磷纳米片整合，研究提供了一种基质引导的策略，支持成骨-血管生成自组织、体内成熟和骨膜微环境的功能性重建，且不依赖于多能干细胞编程。所获得的类器官促进稳健的骨再生，恢复富含periostin的骨膜界面，稳定微血管，并重新平衡骨重塑，共同再现了天然骨膜的关键生物学特征。这一工作的科学价值在于将骨骼再生的范式从材料替代转向活体骨膜界面的重建，揭示了重建调控性组织界面而非递送静态材料的重要性。应用价值方面，该方法为大型且常规无法愈合的骨缺损提供了可广泛应用的平台，且材料制备和打印流程具有可扩展性，具备临床转化潜力。

研究亮点： 第一，首次提出并实现了“骨膜类器官”的概念，将类器官研究的自组织原理应用于骨膜重建领域，突破了传统静态骨膜仿生策略的局限。第二，Gel/SilMA互穿网络与黑磷纳米片的整合策略同时赋予构建体力学稳定性、成骨活性和促血管生成活性，在单一体系中实现了成骨-血管生成的耦合调控，这一设计在材料层面具有创新性。第三，研究采用了从二维筛选到三维构建再到体内成熟的递进式验证路径，逻辑链条完整，特别是通过皮下异位成熟实验证明了构建体无需种植部位骨微环境即可获得骨膜样组织特征，体现了真正的自组织能力。第四，转录组学分析从机理层面揭示了材料通过激活ECM-整合素信号、PI3K-Akt通路和趋化因子信号来协调多细胞程序，为“基质引导的组织自组装”提供了分子证据。此外，研究在动物实验中同时评估了系统炎症、肝肾功能和主要器官病理，为生物安全性提供了较为全面的数据支撑，这对于含有黑磷纳米材料的植入体系而言尤为重要。