本研究由Nathaniel J. Hogrebe, Mason D. Schmidt, Punn Augsornworawat, Sarah E. Gale, Mira Shunkarova, 和 Jeffrey R. Millman* 等研究者共同完成，主要所属机构为华盛顿大学圣路易斯医学院内分泌、代谢与脂质研究部，部分作者来自玛希隆大学西里拉医院医学院免疫学系以及华盛顿大学圣路易斯分校生物医学工程系。该研究以预印本形式发布于bioRxiv平台，版本发布日期为2025年2月11日，其预印本永久识别号为DOI: 10.¹¹⁰¹⁄₂₀₂₄.10.21.618465。

学术背景与研究目的

本研究的核心科学领域是干细胞定向分化与再生医学，特别是聚焦于人类多能干细胞 (human pluripotent stem cells, hPSCs) 向功能性胰岛细胞的分化。研究背景源于对1型糖尿病 (Type 1 Diabetes, T1D) 细胞替代疗法的迫切需求。虽然移植来源于遗体捐赠者的胰岛已被证明可有效恢复血糖稳态，但供体短缺、质量不均和免疫排斥等问题限制了其广泛应用。因此，利用hPSCs分化产生干细胞衍生胰岛 (stem cell-derived islets, SC-islets) 被认为是提供无限量、高质量、可基因编辑的胰岛细胞来源的潜在解决方案。

目前，通过模拟胚胎发育过程，利用生长因子和小分子化合物分步诱导hPSCs的定向分化 (directed differentiation) 协议已能产生SC-islets。然而，现有分化体系仍面临挑战：分化的SC-islets中β细胞比例和功能成熟度有待提高，且常伴随产生肠嗜铬细胞 (enterochromaffin cells) 等脱靶细胞类型；此外，不同hPSC细胞系之间的分化效率存在差异，部分细胞系（如本研究中使用的AN1.1和H1系）分化结果不一致，甚至无法可靠地产生功能性胰岛细胞。这些技术瓶颈直接影响着细胞疗法的安全性（如脱靶细胞或残留多能细胞可能形成肿瘤）和疗效。

有趣的是，已有研究表明细胞骨架 (cytoskeleton)，尤其是肌动蛋白 (actin) 的聚合状态，不仅决定细胞形态和迁移，也深刻影响多种生化信号通路和细胞命运决定。研究团队前期工作发现，在胰腺前体细胞向内分泌细胞分化的关键时刻（本分化协议的第5阶段初期），使用肌动蛋白解聚剂 (F-actin depolymerizing agent) Latrunculin A (Lata) 处理，能克服刚性培养基底对内分泌分化的抑制，促进神经生成素3 (Neurog3) 的表达和内分泌程序的启动。这提示细胞骨架状态在特定分化节点具有关键作用。

基于此，本研究旨在系统探究一个更根本的问题：在hPSCs退出多能性 (exit pluripotency)、开始向特定胚层分化的最初始阶段，肌动蛋白细胞骨架的聚合状态是否影响其命运决定？ 具体来说，研究目标包括：1） 验证在分化的最初24小时调控肌动蛋白聚合/解聚状态，是否影响hPSCs向三个胚层（内胚层、中胚层、外胚层）的定向分化效率；2） 将这一发现应用于SC-islet分化体系，探究在定形内胚层 (definitive endoderm, DE) 形成阶段（第1阶段）使用Lata解聚F-actin，能否优化下游信号动力学、改善胰腺前体细胞特化，并最终产生功能更优、脱靶细胞更少的SC-islets；3） 评估此策略是否能“挽救”那些原本分化效率低下或不一致的hPSC细胞系。

详细工作流程

研究流程可概括为五个主要部分：细胞骨架状态对三胚层分化的普适性影响验证、Lata处理优化SC-islet分化的剂量探索与功能评估、对不一致细胞系的挽救效应与体内移植验证、分子机制探究（信号通路与基因表达动态分析）、以及下游肠道管模式化和胰腺前体特化的深入解析。

第一部分：细胞骨架状态对三胚层分化影响的验证。 研究首先使用商业化三胚层分化试剂盒，在hPSCs向定形内胚层 (DE)、中胚层 (mesoderm) 和外胚层 (ectoderm) 分化的最初24小时内，分别添加促进肌动蛋白聚合的化合物鞘氨醇-1-磷酸 (Sphingosine-1-phosphate, S1P) 或解聚剂Latrunculin A (Lata)。S1P通过激活Rho GTPases间接诱导肌动蛋白聚合；而诺考达唑 (nocodazole) 因导致细胞过度收缩和皮质肌动蛋白聚合也曾被测试。对照为仅含标准分化因子（如DE形成所需的Activin A和CHIR99021）的组别。研究通过免疫荧光染色和定量实时聚合酶链反应 (qRT-PCR) 评估处理结束后多能性标志物（OCT4， NANOG， SOX2）和目标胚层标志物（如DE的FOXA2/SOX17， 中胚层的TBXT， 外胚层的PAX6）的表达水平。

第二部分：优化SC-islet分化协议与功能评估。 在验证了早期细胞骨架状态对DE形成有影响后，研究聚焦于SC-islet分化协议（一个为期5周的分步协议）。他们在协议的第1阶段（DE形成期，共4天）的最初24小时内，向培养基中加入不同浓度的Lata（范围约为0-0.175 µM）。处理24小时后，更换为不含Lata但含Activin A的标准DE培养基完成剩余3天培养。值得注意的是，此“第1阶段Lata处理”是叠加在团队先前已验证的、在第5阶段初期使用的Lata处理之上的。研究使用了四个hPSC细胞系：两个能稳定产生高功能SC-islets的细胞系（HUES8和WS4c），以及两个分化不一致的细胞系（AN1.1和H1）。 评估指标全面且多层次： * 功能评估：分化终点（约第5-6周）对SC-islet簇进行葡萄糖刺激胰岛素分泌 (glucose-stimulated insulin secretion, GSIS) 静态和动态分析，以及钾离子（KCl）和各类促泌剂刺激测试。测定胰岛素含量 (insulin content) 和胰岛素原/胰岛素比例。 * 细胞组成分析：通过流式细胞术 (flow cytometry) 定量最终细胞簇中C肽阳性/NKX6.1阳性β细胞、嗜铬粒蛋白A (ChgA) 阳性内分泌细胞总数以及SLC18A1阳性肠嗜铬细胞的比例。同时通过qRT-PCR检测β细胞标志物（INS， IAPP）及脱靶谱系标志物（如肠道的CDX2、肝细胞的AFP、肠嗜铬细胞的TPH1）的基因表达。 * 体内功能与安全性验证：将AN1.1细胞系在有/无第1阶段Lata处理下分化产生的SC-islets，移植到重症糖尿病小鼠（链脲佐菌素诱导）的肾包膜下。长期监测（长达30周）小鼠的空腹血糖 (fasting blood glucose)、随机血糖，并进行葡萄糖耐量试验 (glucose tolerance test, GTT)。在移植后特定时间点，通过切除移植肾来评估移植物对血糖控制的贡献，并对移植物进行组织学切片和免疫组化染色，检查β细胞（C肽/NKX6.1）的存在和肿瘤形成情况。

第三部分：分子机制探究。 为阐明Lata处理如何改变DE形成和后续分化，研究进行了深入的分子谱学分析： * 单细胞RNA测序 (scRNA-seq)：对HUES8细胞在第1阶段每天（共4天） 进行取样测序，比较Lata处理组与对照组。重点分析多能性基因、DE标志物（FOXA2， SOX17， CER1， GSC等）以及关键信号通路相关基因（如Nodal， Lefty1/2， ID1-4， JUN， WNT通路组分）的时间动态表达模式。 * 单核ATAC测序 (snATAC-seq)：在第1阶段结束时（S2D1）对细胞进行检测，分析染色质可及性 (chromatin accessibility) 差异，特别是关键转录因子结合基序（如SMAD2/3/4， FOS/JUN， HNF1A/B）的可及性变化，以从表观遗传层面印证信号通路活性的改变。 * 蛋白水平验证：在整个第1阶段，通过免疫荧光染色追踪关键蛋白（如LEFTY1/2， NODAL， c-JUN， Transgelin (TAGLN)， β-catenin， OCT4， NANOG）的定位与丰度变化。通过蛋白质印迹法 (Western blot) 定量信号通路效应蛋白的磷酸化状态，如pSMAD2/3（反映Activin/Nodal信号）、pSMAD1/5（反映BMP信号）以及pGSK-3β/总GSK-3β（反映Wnt信号）的比率动态。 * 下游模式化分析：通过scRNA-seq追踪整个分化过程各阶段（从DE到胰腺前体，再到内分泌细胞）的细胞群体和基因表达变化。特别关注视黄酸 (retinoic acid, RA) 信号通路相关基因（CYP26A1， CRABP2， RARA/B及其靶基因）、同源框 (Hox) 基因以及前后肠标志物（如OTX2， CDX2， PDX1， NKX6.1）的表达差异。通过免疫染色在蛋白水平验证关键发现（如OTX2， ONECUT1， PDX1）。 * 信号通路功能验证：在Lata处理的背景下，于第1阶段后期（S1D2开始）加入BMP信号抑制剂LDN193189，观察是否阻断了Lata带来的胰腺前体（PDX1+/NKX6.1+）特化改善效应，从而反向验证BMP信号增强的必要性。 * 单核多组学测序 (snMulti-omics)：在分化终点（S6D15），对聚集形成的SC-islet簇同时进行RNA测序和ATAC测序，从转录组和表观基因组两个维度综合评估不同细胞类型（特别是β细胞和肠嗜铬细胞）的身份成熟度 (identity maturity) 和基因调控状态。

主要研究结果

1. 肌动蛋白聚合状态在分化起始阶段对三胚层特化具有普适且背景依赖性的影响：在DE和中胚层分化中，最初24小时使用Lata解聚F-actin能显著降低多能性基因（OCT4， NANOG， SOX2）表达，并增强目标胚层标志物（FOXA2或TBXT）表达，表明促进了更彻底的多能性退出和谱系特化。相反，使用S1P促进肌动蛋白聚合则维持了高水平的多能性基因，并抑制了DE标志物表达。然而，在外胚层分化中，情况恰好相反：S1P处理促进了外胚层标志物PAX6的表达并降低了多能性基因。因此，解聚的细胞骨架有利于中内胚层谱系，而聚合的细胞骨架则有利于外胚层分化。

2. 第1阶段Lata处理剂量依赖性地改善SC-islet的功能和组成：对于四个测试的hPSC系，在0.1 µM至0.175 µM（H1系用0.1375 µM）的Lata浓度范围内，SC-islets表现出显著增强的葡萄糖刺激胰岛素分泌能力，其胰岛素含量也大幅提高，某些指标甚至接近或超过原代人胰岛。流式分析显示，Lata处理使SC-β细胞比例增加了约5-10%，同时减少了肠嗜铬细胞的比例（约5-15%）。基因表达分析证实β细胞相关基因上调，而脱靶谱系基因下调。重要的是，即使按每个β细胞标准化后，胰岛素分泌能力仍提高，表明Lata不仅增加了β细胞数量，还改善了其功能成熟度。

3. 第1阶段Lata处理“挽救”了分化不一致的细胞系：在没有Lata处理时，AN1.1和H1细胞系在第1阶段结束时仍高表达多能性基因，且后续分化结果不稳定，常产生混合的脱靶细胞或完全无法产生内分泌细胞。而Lata处理能强制驱动这些细胞更彻底地退出多能性，使其成功分化为高质量的SC-islets。最有力的证据来自体内移植实验：未经Lata处理的AN1.1 SC-islets移植后降糖缓慢，并在第11周形成肿瘤；而经0.175 µM Lata处理的AN1.1 SC-islets能迅速（1-2周内）将重症糖尿病小鼠的血糖恢复至正常水平，效果与原代人胰岛移植相当，且长期（30周）维持血糖稳定，无肿瘤形成。移植物中含有大量健康的C肽+/NKX6.1+ β细胞。

4. Lata处理改变了DE形成期的关键信号动力学：scRNA-seq和snATAC-seq分析揭示，Lata处理虽然在最初24小时后细胞形态和大多数基因表达与对照相似，但随着第1阶段进行，处理组细胞逐渐形成一个独特的DE群体。主要信号变化包括：Activin/Nodal信号（通过Nodal， Lefty1/2表达下降，pSMAD2/3降低证实）和JNK-JUN信号（c-JUN蛋白早期升高后迅速清除）在后期被强烈抑制；而BMP信号（通过ID1-4基因表达上调和pSMAD1/5增加证实）在后期增强。此外，Wnt信号（β-catenin膜定位变化，pGSK-3β/总GSK-3β比率动态改变）和金属硫蛋白基因表达也发生改变。这些独特的信号模式构成了“优化版”DE的分子特征。

5. 信号动力学的改变导致下游肠道管模式化优化和胰腺前体特化增强：尽管对照组和Lata处理组在第1阶段末都产生了高纯度的FOXA2+/SOX17+ DE细胞，但随后的模式化过程不同。Lata处理细胞表现出对视黄酸 (RA) 信号更好的响应准备（如早期CYP26A1表达低、CRABP2表达高），并在RA处理阶段（第3阶段）表现出更强的RA信号激活（RA靶基因如HOX基因表达更高）和FGF8表达抑制。这导致前肠前部标志物（如OTX2）下调更快，而后前肠/胰腺区域标志物（如PDX1， ONECUT1）表达更强。最终，在第4阶段末，Lata处理组产生了更高比例的PDX1+/NKX6.1+胰腺前体细胞，并减少了肝脏（AFP）和肠道（CDX2）等脱靶谱系标志物的表达。单细胞测序显示，分化终点时Lata处理组β细胞比例更高，肠嗜铬细胞比例更低，且β细胞的转录组和表观基因组特征更成熟。

结论与意义

本研究得出结论：在hPSCs定向分化的起始阶段，肌动蛋白细胞骨架的聚合状态是一个关键的命运决定因素。 通过在该时间窗口特异地调控细胞骨架，可以显著优化细胞退出多能性的效率，并改变后续发育信号通路的时间动力学，从而改善目标细胞类型的特化和功能。

其科学价值在于：1） 揭示了细胞骨架状态作为多能性退出和早期谱系特化的一个普适性调控模块，深化了对干细胞生物学和发育过程中力学-生化信号耦合的理解。2） 阐明了早期短暂的细胞骨架干预如何产生长期的、级联式的效应，通过改变Activin/Nodal， BMP， JNK-JUN， Wnt和RA等多条关键信号通路的动力学，最终重塑肠道管模式化和器官特化结局。3） 为理解不同hPSC细胞系间分化效率差异提供了新视角（如AN1.1和H1系内源性c-JUN和F-actin的异质性可能导致了其退出多能性困难）。

其应用价值巨大：1） 提供了一种简单、可操作的策略来显著提升SC-islet分化协议的性能：仅需在现有协议第1阶段开始添加低浓度Lata处理24小时，即可同步提高β细胞产量、功能成熟度、分化一致性，并减少安全隐患（脱靶细胞和肿瘤风险）。2） 极大地提高了分化协议的鲁棒性和细胞系适应性，使得原本难以使用的hPSC细胞系也能用于产生治疗级细胞产品，这对基于细胞系的疗法标准化和规模化至关重要。3） 为其他干细胞定向分化体系（如产生肝细胞、神经元、心肌细胞等）的优化提供了新的思路和潜在工具，提示早期细胞骨架调控可能是一个普适性的优化杠杆。

研究亮点

1. 新颖的科学发现：首次系统论证并应用了“分化起始阶段肌动蛋白解聚促进中内胚层特化”这一普适性规律，并成功将其转化为提升SC-islet分化效率的具体方案。
2. 强大的挽救效应：不仅优化了已能良好分化的细胞系，更重要的是能“挽救”分化失败的细胞系批次，并经过严格的体内实验证实了其疗效和安全性（根除高血糖且无肿瘤），这对于临床转化中应对细胞系变异具有关键意义。
3. 深入且多维的机制解析：研究并未停留在表型描述，而是通过scRNA-seq， snATAC-seq， 单核多组学、磷酸化蛋白分析等多层次技术，清晰地描绘了从早期细胞骨架扰动，到关键信号通路动力学改变，再到下游基因表达和表观遗传重编程，最终决定细胞命运的完整逻辑链条。
4. 明确的实用指导：论文详细给出了Lata处理的浓度范围、细胞形态判断标准、注意事项（如会增加特定时间点的细胞死亡）等实操细节，使其方法易于被其他实验室重复和应用。
5. 对领域内挑战的直接回应：该研究直接针对SC-islet领域长期存在的功能不成熟、脱靶细胞多、细胞系间差异大等核心问题，提供了有效的解决方案。

这项工作是一项兼具重要基础理论发现和重大转化应用潜力的优秀研究，为干细胞