王天彩、陈晨*、马朦朦、杨茜、李耘、钱永忠（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所）于2021年在《农药学学报》（Chinese Journal of Pesticide Science）发表了题为《五种农药及其二元、三元组合对人肝癌HepG2细胞的联合毒性》的研究论文（DOI: 10.16801/j.issn.1008-7303.2021.0021）。该研究聚焦农产品中农药混合污染的联合毒性问题，选取生菜中高频检出的5种农药（苯醚甲环唑、氯氰菊酯、烯酰吗啉、氯氟氰菊酯和啶虫脒）及其二元、三元组合为研究对象，系统评估了其对HepG2细胞的增殖抑制和凋亡诱导效应。

学术背景

农药多残留引发的联合毒性是当前食品安全领域的重大挑战。全球农药年用量达183万吨，中国占比5.23%，但现有农药限量标准仅针对单一农药，忽视了混合污染的协同或拮抗效应。既往研究表明，捷克耕地土壤中农药检出率高达98.7%，波兰水果中46.3%样本含2-8种农药残留。肝脏作为外源性物质代谢的主要器官，HepG2细胞系被广泛用于毒性研究。本研究通过CCK-8法（Cell Counting Assay Kit-8）和高内涵筛选系统，结合浓度相加（CA）、独立作用（IA）和联合指数（CI）模型，首次系统评估了生菜中典型农药组合的细胞毒性机制。

研究流程与方法

1. 细胞培养与染毒
   HepG2细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，采用胰蛋白酶消化传代。农药标准品用DMSO配制母液，最终染毒浓度中DMSO含量<0.1%。混合物按等毒性效应配比暴露。

2. 细胞活力测定
   通过CCK-8法检测24小时暴露后的细胞增殖抑制率，计算半数抑制浓度（EC50）。实验设置5个浓度梯度（0.25×EC50至4×EC50），每组设3个复孔。

3. 联合毒性模型构建

   • CA模型：假设组分作用模式相似，按公式ECx,mix=(∑(pi/ECx,i))^-1计算混合效应。
     
   • IA模型：基于组分作用机制独立假设，公式为E(cmix)=1-∏(1-E(ci))。
     
   • CI模型：通过CompuSyn软件分析，CI<1、=1、>1分别表示协同、相加和拮抗作用。协同效应下计算剂量减少指数（DRI）。

4. 凋亡检测
   采用Annexin V-FITC/PI/Hoechst三联染色，通过高内涵筛选系统（Operetta CLS）定量分析早期/晚期凋亡率，暴露浓度为0.25×EC50至EC50。

主要结果

1. 单剂毒性排序
   苯醚甲环唑毒性最强（EC50=24.72 μmol/L），其余依次为烯酰吗啉（38.14 μmol/L）>氯氟氰菊酯（43.04 μmol/L）>啶虫脒（74.27 μmol/L）>氯氰菊酯（127.88 μmol/L）。

2. 联合效应动态变化

   • 所有二元组合在低浓度区呈拮抗（CI>1），高浓度区转为协同（CI）。例如烯酰吗啉+苯醚甲环唑在EC50时CI=0.47。
     
   • 三元组合中，烯酰吗啉+苯醚甲环唑+氯氰菊酯在抑制率60%时由协同（CI=0.53）转为拮抗；烯酰吗啉+氯氰菊酯+啶虫脒在18%抑制率时发生相同转变。

3. 协同作用量化
   10%效应水平下，三元组合中氯氰菊酯的DRI值最高（35.82倍），表明其主导协同效应。20%效应时，烯酰吗啉+氯氰菊酯+啶虫脒转为拮抗（CI=1.43），啶虫脒DRI仅1.54倍。

4. 凋亡诱导机制
   苯醚甲环唑单剂在EC50时诱导90.11%早期凋亡和19.20%晚期凋亡。三元组合烯酰吗啉+氯氰菊酯+啶虫脒在20.02-80.10 μmol/L范围内凋亡率显著高于单剂（p<0.01），与CI模型预测一致。

结论与价值

本研究首次揭示农药混合物联合效应的浓度依赖性转换规律：二元组合普遍呈现”低拮抗-高协同”特征，而三元组合存在协同阈值。CI模型较传统CA/IA模型更精准（R²>0.95），为混合农药风险评估提供了可靠工具。发现氯氰菊酯在三元协同中的关键作用，提示其在农药复配方案中需重点监控。凋亡实验证实混合暴露可能通过线粒体/内质网通路放大毒性，为制定基于作用机制的限量标准提供依据。

研究亮点

1. 方法创新：整合CI模型与高内涵筛选技术，实现从细胞增殖到凋亡的多维度毒性评估。
   
2. 发现新颖性：首次报道三元组合的”协同-拮抗”转换阈值，突破传统二元交互研究局限。
   
3. 应用价值：建立的DRI量化体系可直接指导农药复配方案优化，减少田间用量30%以上。
   

该研究被列为国家重点研发计划（2018YFC1603000）和国家自然科学基金（31771894）成果，相关模型已应用于我国农产品风险监测体系。