本研究由Alice L. B. Pyne、Agnes Noy和Sarah A. Harris等人主导，联合了英国谢菲尔德大学、约克大学、伦敦大学学院、约翰英纳斯中心等多所研究机构，于2021年发表于《Nature Communications》。研究聚焦于DNA超螺旋结构对双螺旋局部构象及大沟（major groove）分子识别的影响，特别是通过三链形成寡核苷酸（triplex-forming oligonucleotides, TFOs）的结合来探究超螺旋DNA的力学与识别机制。

在细胞内，基因组DNA通常处于高度组织化和拓扑约束的超螺旋状态。负超螺旋应力源于闭合环状DNA双链间连接数（linking number, Lk）的减少，其构象响应表现为螺旋的解旋（twist变化）和骨架的缠绕变形（writhe）。传统高分辨率结构生物学手段如X射线晶体学和核磁共振难以解析超螺旋DNA的高度异质构象，这限制了对超螺旋如何影响DNA局部结构及分子识别的理解。TFO是一类能特异性识别双链DNA大沟并形成三链结构的寡核苷酸，因其基因表达调控潜能而被开发为抗癌工具。三链形成需要DNA局部解旋以容纳第三条链，因此TFO是研究超螺旋依赖性DNA识别的理想模型。本研究旨在结合高分辨率原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）和原子级分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟，在碱基对分辨率下揭示负超螺旋对DNA微小环（minicircle）局部及整体结构、动态和TFO识别的影响。

研究使用了250–340 bp的DNA微小环作为模型体系，这些分子足够小以进行原子级MD模拟和AFM高分辨率成像，同时也代表了拓扑结构域末端的环状结构及人类细胞中的染色体外环状DNA。研究通过λ整合酶位点特异性重组在体内制备339 bp和251 bp的微小环，并掺入了一个16 bp的TFO结合序列（TBS）。通过缺口-再连接方法在溴化乙锭存在下生成不同负超螺旋密度的拓扑异构体（topoisomer），超螺旋密度范围从松弛态（δLk=0）到δLk=−4.9。

实验流程包括：（1）利用高分辨率AFM在液相中对吸附于云母表面的DNA微小环进行成像，获得双螺旋级别的结构信息，并直接测量扭转数（twist）和缠绕数（writhe）以确定连接数；（2）构建对应不同拓扑异构体的原子模型，采用AMBER99力场配合parmbsc0、parmol4、parmol1等骨架二面角修正，在隐式和显式溶剂中进行MD模拟，以采样超螺旋微小环的构象系综；（3）通过曲率分析程序serraline计算弯曲角度，区分B型DNA弯曲与缺陷（kinks或denaturation bubbles）；（4）在优化的静电条件下（100 mM Ca²⁺, pH 4.8）通过表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）测定TFO与不同超螺旋密度微小环的结合亲和力；（5）基于MD轨迹进行能量分解，分别计算TFO结合位点的局域非键相互作用（包括Hoogsteen氢键、堆叠、骨架氢键）和整体静电贡献。

AFM成像结果显示，负超螺旋微小环呈现丰富的构象多样性，251 bp微小环的平均扭转数为24±1圈，对应螺旋重复10.5±0.5 bp，与经典B型DNA一致。AFM和MD均观察到在δLk=−1及更低拓扑异构体中，DNA出现局部缺陷，包括I型扭结（type I kinks，单个碱基对氢键断裂并强弯曲）和变性气泡（denaturation bubbles，两个或以上碱基对翻出双链）。曲率分析显示，B型DNA在约1.5个螺旋圈（16 bp或5 nm弧长）内可承受最大约75°的弯曲而不发生结构破坏，而缺陷区域的弯曲角平均可达106±15°（AFM）和120±32°（MD）。该临界弯曲角意味着一个无缺陷的plectoneme环必须宽于7–10 nm，即至少包含约55 bp或五个螺旋圈。

整体构象分析表明，负超螺旋密度增加导致DNA微小环全局压实，表现为AFM测量的纵横比（aspect ratio）下降35%，MD中回转半径（radius of gyration）减小。然而在生理超螺旋密度附近（δLk≈−2, σ≈−0.06），出现了反常的压实度降低，这与较大缺陷的出现相吻合。缺陷通过局部熔解释放扭转应力，使DNA部分松弛。比较同一拓扑异构体中含有缺陷（writhe=−1.1±0.1圈）与无缺陷（writhe=−1.7±0.1圈）的模拟构象，发现缺陷可使writhe减少0.6圈。当超螺旋进一步增加时，缺陷不足以吸收全部扭转应力，DNA重新趋向更强的缠绕和压实。

在TFO结合实验中，SPR数据显示TFO与DNA微小环的结合解离常数（Kd）在10 pM量级，且在δLk=0至−4.9范围内几乎不受超螺旋密度影响。AFM图像显示三链形成表现为DNA上的亚纳米突起，定位于预期的TBS位点。MD模拟的能量分解揭示了这一反直觉现象的分子机制：负超螺旋增加局部负电荷密度，导致静电惩罚上升，但同时促进TFO与Watson–Crick嘧啶链之间的分叉氢键（bifurcated hydrogen bonds）及TFO碱基与嘌呤链骨架之间的弱氢键形成，从而以额外的氢键能补偿静电损失。此外，负超螺旋预置DNA处于低扭转状态，有利于三链形成所需的局部解旋。相反，正超螺旋（δLk=+1）则破坏Hoogsteen氢键，不利于三链形成。对于δLk=−6的高度压实拓扑异构体，TFO结合导致writhe显著减少0.5±0.1圈，构象分布向更开放的形态偏移；而对于其他拓扑异构体，TFO结合则使writhe分布变窄，表明构象灵活性受到限制。

该研究的主要结论是：负超螺旋应力在DNA微小环中诱导局域B型结构的变异，通过引入扭结和缺陷影响全局构象与柔性；TFO结合的能学由静电与氢键相互作用的精细平衡支配，使三链形成在广泛的超螺旋密度范围内均能发生。这一机制揭示了超螺旋如何通过提升DNA的自由能景观至相对平坦的状态而增强构象适应性，从而增加潜在识别位点的多样性。DNA超螺旋为约1.5个螺旋圈长度尺度的信息提供了一种放大机制——全局构象可因一个仅16 bp的配体结合而发生改变或构象分布受限。

本研究的亮点包括：首次在碱基对分辨率下同时捕捉到负超螺旋DNA微小环的整体构象多样性与局部缺陷，并定量给出了B型DNA在超螺旋应力下的临界弯曲角75°；通过多尺度模拟与高分辨率AFM的定量比较，验证了MD力场对DNA扭转和弯曲响应的再现能力；发现了生理超螺旋密度下DNA压实度降低的反常现象，并归因于缺陷介导的应力释放；揭示了TFO结合能学中静电惩罚与额外氢键补偿之间的平衡，解释了超螺旋密度对三链形成亲和力影响甚微的实验观察；证明了小环DNA中短序列配体结合可引起全局拓扑状态的改变，为超螺旋作为基因表达调控与分子识别变构调节机制提供了新见解。该工作对DNA纳米技术、小环DNA治疗应用、CRISPR-Cas9基因编辑中引导序列的定位以及超螺旋依赖性基因调控等领域具有潜在的指导意义。