作者及机构
本研究的通讯作者为上海交通大学医学院附属仁济医院的Qiong Fu和中国科学院上海免疫与感染研究所的Xiaoming Zhang教授，第一作者为Chunmei Wu等。该研究团队由来自上海交通大学医学院、中国科学院、苏州血站等多家机构的科研人员组成，研究成果发表在Annals of the Rheumatic Diseases期刊（2024年9月刊，DOI:10.1136/ard-2024-225876）。
研究领域与动机
系统性红斑狼疮（SLE）是一种自身免疫性疾病，其中狼疮肾炎（LN）是导致患者死亡的主要原因。尽管已知B细胞和T细胞在LN肾脏中大量浸润，但其具体致病机制尚不清楚。既往研究发现，LN肾脏中富集非典型B细胞（atypical B cells, ABCs）、抗体分泌细胞（antibody-secreting cells, ASCs）和CD8 T细胞，暗示局部组织可能存在滤泡外B细胞反应，但缺乏分子层面的证据。因此，本研究旨在通过单细胞技术解析LN肾脏中适应性免疫细胞的异质性，阐明其与疾病进展的关系。
科学问题
1. LN肾脏中B细胞和T细胞的组成及功能特征是什么？
2. 滤泡外B细胞反应是否在肾脏中活跃发生？
3. CD8 T细胞如何与B细胞相互作用并参与LN发病？
研究对象与样本
研究纳入了6例活动性LN患者的肾脏活检组织和配对外周血样本，以及4例健康对照的外周血样本。通过流式细胞术分选CD19+ B细胞（包含CD38hi ASCs）和CD3+ T细胞，进行以下分析：
实验流程
1. 单细胞多组学测序
- 单细胞RNA测序（scRNA-seq）：使用10x Genomics平台对52,939个高质量B细胞和T细胞进行转录组分析，通过t-SNE聚类鉴定出20个细胞亚群。
- 单细胞BCR/TCR测序（scBCR/scTCR-seq）：解析B细胞和T细胞的克隆扩增及受体特征。
- 配套验证实验：
- 流式细胞术：验证肾脏中GZMK+ CD8 T细胞的丰度。
- 多重免疫组化（mIHC）：定位ABCs（CD20+T-bet+）、ASCs（CD20−CD38hiCD79a+）及GZMK+ CD8 T细胞在肾脏中的空间分布。
- 染色质可及性测序（ATAC-seq）：分析GZMK+ CD8 T细胞中IFNG和IL21位点的表观遗传修饰。
创新方法
- 结合空间转录组（mIHC）与单细胞测序，首次在LN肾脏中定位滤泡外B细胞反应与T细胞的共定位。
- 开发CCR5替代标记策略分离GZMK+ CD8 T细胞，解决肾脏活细胞分选难题。
1. LN肾脏中存在显著的滤泡外B细胞反应
- 细胞组成：肾脏中ABCs（B4-abc）和静息ASCs（B6-rasc）比例显著高于外周血（p<0.001），且与AMP研究相比，本研究ABCs比例更高。
- 克隆特征：
- 肾脏ASCs以IGHG1和IGHG3亚型为主（占70%），IGHV4-59家族克隆扩增显著（p<0.01）。
- 与外周ASCs相比，肾脏ASCs的IGHV/IGLV体细胞突变频率更低（p<0.05），符合滤泡外反应特征。
2. GZMK+ CD8 T细胞为肾脏主导T细胞亚群
- 转录特征：高表达IFNG、TNFRSF9等炎症因子，且表观遗传分析显示IFNG位点开放程度增加。
- 功能验证：体外实验证实，CCR5+（GZMK+）CD8 T细胞通过分泌IFN-γ和IL-21促进ABC分化（中和抗体抑制率>50%）。
3. ABCs与GZMK+ CD8 T细胞形成病理微环境
- 空间共定位：mIHC显示两种细胞在三级淋巴结构（TLS）中紧密聚集，且浸润密度与疾病活动度正相关（r=0.62, p<0.01）。
- 信号通路共享：共同富集炎症（TNF-α/NF-κB）、应激（缺氧、p53）等通路。
科学价值
1. 机制创新：首次揭示LN肾脏中滤泡外B细胞反应与GZMK+ CD8 T细胞的协同作用，提出“ABC-CD8 T细胞生态位”驱动局部炎症的假说。
2. 临床意义：为靶向IFN-γ/IL-21或耗竭组织驻留B细胞的治疗策略提供依据，例如CD19 CAR-T或obinutuzumab的应用潜力。
研究亮点
- 单细胞多组学整合：率先联合scRNA-seq、scBCR/TCR-seq和ATAC-seq解析LN免疫微环境。
- 临床关联性：发现GZMK+ CD8 T细胞浸润与难治性LN相关，或可作为预后标志物。
本研究为LN的精准治疗提供了新视角，未来或可开发针对滤泡外反应和CD8 T细胞的联合干预方案。