本文属于类型a（单一原创研究报告）。以下是对该研究的学术报告。
一、作者、机构与发表信息
本研究发表于 nature 期刊，通讯作者为 qi liu 和 julia carnevale。主要完成机构包括加州大学旧金山分校（UCSF）、格拉斯通研究所（Gladstone Institutes）等多家单位。研究团队涵盖了肿瘤免疫学、T细胞工程、CRISPR筛选、代谢与信号转导等多个领域的学者。
二、研究背景与目的
T细胞免疫疗法在血液系统恶性肿瘤中取得了显著疗效，但在实体瘤中的广泛应用仍面临重大挑战。实体瘤微环境（tumour microenvironment，TME）对T细胞施加了多重障碍，包括浸润受限、代谢压力以及免疫抑制等。CRISPR筛选技术为发现能够克服这些障碍的基因修饰提供了前所未有的机会。然而，大多数体外筛选无法真实模拟实体瘤的结构屏障、营养梯度、抑制性免疫细胞和组合性抑制配体，因此许多仅在TME中才能显现功能的基因靶标被系统性遗漏。
此前在荷瘤免疫缺陷小鼠中对人类T细胞进行混合遗传筛选的尝试，由于肿瘤内T细胞回收率低（通常每个肿瘤仅能回收5万至50万个细胞），筛选被限制在小型亚文库中，难以实现全基因组覆盖。本研究旨在开发一种能够在荷瘤小鼠中对原代人T细胞进行体内全基因组CRISPR筛选的平台，以鉴定调控实体瘤中T细胞浸润和效应功能的关键基因，并进一步将其转化为提高T细胞治疗效果的新策略。
三、研究流程与实验方法
1. 建立高回收率体内筛选平台。 研究团队首先对A375黑色素瘤细胞进行基因工程改造，使其表达抗CD3单链可变片段（single-chain variable fragment，scFv）。该scFv能够结合并激活任何多克隆CD8⁺/CD4⁺ T细胞，从而绕过了抗原特异性的限制，显著提高了肿瘤内T细胞的回收数量。他们从70个慢病毒转导的单细胞克隆中筛选出27个覆盖不同抗CD3 scFv表达水平的克隆，并通过体外杀伤实验选出低、中、高三个具有不同杀伤敏感性的克隆。将这三个克隆分别植入NSG小鼠并给予多克隆人T细胞后，A375low和A375medium肿瘤分别可回收约700万和3000万个T细胞，远高于野生型A375联合NY-ESO-1 TCR T细胞的约20万个。A375low肿瘤中的T细胞表现出更高的耗竭水平（CD39升高）和更低的活化水平（CD69降低），因此被选用于后续实验，以兼顾T细胞回收量和功能障碍的诱导。
2. 验证平台的有效性。 研究团队利用已知的T细胞体内扩增负调控因子ZC3H12A（编码regnase-1）进行验证。将ZC3H12A敲除的T细胞与AAVS1对照编辑的T细胞按1:1混合后共转移至荷瘤小鼠，14天后ZC3H12A敲除T细胞在肿瘤和脾脏中均表现出显著的竞争性富集，证实该平台能够识别增强体内T细胞适应性的基因编辑。此外，他们还通过CD39表达水平分选肿瘤浸润T细胞，发现CD39低表达TIL的体外杀伤能力显著优于CD39高表达TIL，证明该平台支持基于丰度和基于功能的双重筛选读数。
3. 全基因组CRISPR敲除丰度筛选。 使用Brunello文库（约77000条sgRNA）对来自两名供体的原代人T细胞进行全基因组CRISPR敲除，输入覆盖度约500倍，回收覆盖度超过1000倍。编辑后的T细胞池输注至A375low荷瘤NSG小鼠，10天后分别收获肿瘤和脾脏中的T细胞，提取DNA进行sgRNA测序。使用MAGeCK算法分析肿瘤与输入、脾脏与输入之间sgRNA的富集或耗竭情况，并进行KEGG、GO通路富集分析和基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）。同时，将结果与已发表的体外筛选数据进行比较。
4. P2RY8功能与机制验证。 通过体外transwell迁移实验检测P2RY8敲除T细胞对CXCL12的迁移能力，并利用WEHI-231细胞的P2RY8配体生物测定法检测肿瘤上清液中P2RY8配体（s-geranylgeranyl-l-glutathione，GGG）的分泌。液相色谱-串联质谱进一步证实肿瘤细胞直接分泌GGG。在三种抗原特异性模型（CD19-A375联合CD19-28z CAR、野生型A375联合NY-ESO-1 TCR、OE19联合CLDN18.2-28z CAR）中进行体内迁移竞争实验，共转移P2RY8敲除与AAVS1对照T细胞，48小时后分析肿瘤和脾脏中的T细胞分布。此外，在CD19-A549、CD19-AsPC-1和CD19-A375等实体瘤模型中评估P2RY8敲除CAR T细胞的肿瘤控制效果。
5. 全基因组CRISPR敲除IFNγ功能筛选。 对肿瘤浸润T细胞进行体外再刺激，通过流式细胞术分选IFNγ高表达（前20%）和低表达（后20%）的细胞群体，分别提取DNA进行sgRNA测序。使用MAGeCK分析IFNγ高与低群体之间sgRNA的富集和耗竭，鉴定调控T细胞效应功能的基因。随后，在CD19-A549 NSCLC模型中对筛选到的GNAS和STUB1敲除进行单个验证，比较其对肿瘤控制的影响，最终优先聚焦于GNAS。
6. GNAS机制解析。 将CD19-28z CAR T细胞与肿瘤细胞共培养，分别加入前列腺素E2（PGE2）、A2A受体激动剂CGS21680、酸性pH（HCl）和多巴酚丁胺，单独或联合处理，测定GNAS敲除与AAVS1对照CAR T细胞的杀伤能力、扩增、活力、细胞因子产生以及代谢活性（OCR和ECAR）。此外，将来自卵巢癌患者的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）转导HER2特异性CAR并敲除GNAS，在抑制性配体组合存在下检测其杀伤功能。
7. GNAS敲除治疗效果的广泛验证。 在多种实体瘤模型（CD19-A375、CD19-AsPC-1、MES-SA、OE19、A549转移性肺癌）以及多种CAR/TCR系统（CD19-28z CAR、B7H3-BBz CAR、CLDN18.2-28z CAR、NY-ESO-1 TCR）中比较GNAS敲除与AAVS1对照T细胞的肿瘤控制效果。在B16-OVA免疫健全模型中测试小鼠GNAS敲除OT-I T细胞的疗效。通过肿瘤再激发评估记忆形成和持久性。利用Bulk RNA测序分析GNAS敲除肿瘤浸润T细胞的转录组变化。
8. 安全性评估与双敲除联合策略。 对GNAS敲除CAR T细胞进行安全性评估，包括刺激依赖性增殖、抗原特异性杀伤、细胞因子撤除收缩、抗原阴性肿瘤的非特异性杀伤、基线转录组比较以及CRISPRoff表观遗传沉默验证。在小鼠模型中观察体重、临床体征、器官组织病理学改变。最后，将GNAS与P2RY8双敲除CAR T细胞与单敲除及对照进行比较，在CD19-A549模型上评估肿瘤控制效果。
四、主要结果
1. 高回收率体内筛选平台的建立。 A375low和A375medium肿瘤中的T细胞回收量比传统抗原特异性模型高1至2个数量级。A375low肿瘤浸润T细胞与同一小鼠脾脏T细胞相比，表现出CD39和PD1表达升高、CD69和Ki-67表达降低、TNF和IFNγ产生减少、干细胞记忆表型频率下降以及代谢活性受损等特征，表明该模型成功诱导了类似患者TIL的功能障碍状态。ZC3H12A敲除T细胞的体内竞争性富集证实了平台能够反映体内T细胞适应性。
2. 丰度筛选揭示GPCR信号通路调控肿瘤内T细胞丰度。 肿瘤与输入比较中富集了许多已知的T细胞负调控因子，如ZC3H12A、SOCS1、PTGER4、MAP4K1和TNFAIP3等；同时，T细胞活化的正调控因子（LCP2、STAT3、IL2RA等）在肿瘤和脾脏中均被耗竭。GSEA显示GPCR信号通路组分在肿瘤富集基因中显著富集，但在脾脏富集基因中不显著，提示GPCR在肿瘤内T细胞功能障碍中具有特殊作用。与已发表的体外筛选数据相比，体内筛选对GPCR通路组分的富集更强且更一致。
3. P2RY8–Gα13轴限制T细胞肿瘤浸润。 肿瘤与脾脏差异富集分析中，前30个命中基因中有6个（S1PR1、GNA13、CXCR4、ARHGEF1、PTGER4和P2RY8）与GPCR信号和淋巴细胞迁移相关。P2RY8、GNA13和ARHGEF1构成同一条信号轴。P2RY8在人类中存在，但在小鼠中缺乏功能性直系同源基因，因此无法在完全小鼠的体内筛选中被发现。肿瘤上清液能够抑制P2RY8⁺ WEHI-231细胞的迁移，但对P2RY8⁻细胞无效，且P2RY8敲除人T细胞在肿瘤上清液存在下对CXCL12的迁移增强。质谱证实肿瘤细胞分泌GGG。在三个抗原特异性模型中，P2RY8敲除T细胞在48小时内均选择性富集于肿瘤而非脾脏，支持P2RY8在限制T细胞进入肿瘤中的作用。然而，在肿瘤控制方面，P2RY8单敲除仅导致生长较慢的肿瘤（A549和AsPC-1）出现生长减缓趋势，在快速生长的A375模型中无显著优势。
4. IFNγ功能筛选鉴定GNAS为T细胞功能障碍的关键驱动因子。 IFNγ高与低群体比较中，富集了许多已知的T细胞治疗增强靶点（TNFAIP3、DGKZ、RASA2、CBLB），也发现了多个此前未与T细胞功能相关的新基因。GSEA再次显示GPCR信号通路组分的富集，其中GNAS、GNA13和STUB1评分最高。GNAS和STUB1在肿瘤丰度筛选中未出现耗竭，说明它们在功能筛选中被特异性捕获。单基因验证显示，GNAS敲除在CD19-A549模型中的肿瘤控制效果显著优于STUB1敲除，因此被优先深入研究。聚焦亚文库筛选在NY-ESO-1 TCR和A375low两个系统中均证实GNAS和筛选到的其他顶级命中基因的重现性。
5. GNAS整合多种抑制性GPCR信号。 GNAS编码Gαs，是多种感知TME抑制性配体的GPCR（腺苷受体A2AR、前列腺素受体EP2/EP4、酸感受器GPR65、β肾上腺素能受体）下游的共同信号节点。在单独抑制性配体存在下，GNAS敲除CAR T细胞的杀伤优势有限，但当所有四种配体联合存在时，AAVS1对照细胞被强烈抑制，而GNAS敲除细胞保持了扩增、活力、活化和细胞因子及效应分子产生。代谢分析显示GNAS敲除T细胞在抑制性条件下维持了OCR和ECAR。与体外腺苷单刺激筛选相比，GNAS在体内筛选中的排名远高于体外（体内排名第11，体外排名第836），印证了体内多重抑制信号汇聚的重要性。GNAS敲除还能保护卵巢癌患者来源的TIL在抑制性条件下的杀伤功能。
6. GNAS敲除在多种实体瘤模型中显著增强T细胞治疗。 在CD19-A375模型中，接受GNAS敲除CAR T细胞治疗的6只小鼠全部实现完全且持久的肿瘤清除，而AAVS1对照组仅有1/6控制肿瘤。再激发实验显示GNAS敲除CAR T细胞具有持久的抗原特异性记忆。在低剂量CAR T细胞条件下，GNAS敲除CAR T细胞在肿瘤中的积累量约为对照的20倍，且CD39平均荧光强度降低近10倍。在CD19-AsPC-1胰腺癌、B7H3-MES-SA肉瘤、CLDN18.2-OE19胃食管癌以及A549转移性肺癌模型中，GNAS敲除均表现出显著的肿瘤控制优势。Bulk RNA测序显示GNAS敲除导致效应细胞因子、细胞毒性分子、共刺激通路、干性相关程序以及肿瘤归巢趋化因子受体上调，同时抑制性受体和T细胞信号负调控因子下调，且经典T细胞耗竭签名被耗竭。在TCR系统（NY-ESO-1 TCR）和免疫健全小鼠模型（B16-OVA OT-I）中，GNAS敲除同样增强了肿瘤控制。
7. GNAS敲除展现出良好的安全性。 GNAS敲除CAR T细胞在基线转录组上与AAVS1对照几乎相同，仅在暴露于抑制性配体后才出现差异。其增殖、杀伤和收缩均保持抗原和细胞因子依赖性，无针对抗原阴性肿瘤的脱靶杀伤。CRISPRoff表观遗传沉默复现了基因删除的效应。在多个体内模型中观察70至150天，未出现体重下降或临床毒性体征，器官组织病理学评估未见治疗相关损伤或恶性转化。
8. P2RY8–GNAS双敲除协同增强肿瘤清除。 在CD19-A549 NSCLC模型中，GNAS单敲除已表现出显著优势，而P2RY8–GNAS双敲除进一步提高了肿瘤控制效果，达到完全清除的小鼠比例更高。双敲除CAR T细胞在肿瘤实质中的浸润最为显著，且未观察到毒性。
五、结论与意义
本研究开发了一种能够在荷瘤小鼠中对原代人T细胞进行全基因组CRISPR筛选的高效平台，克服了以往体内筛选中T细胞回收率低的瓶颈。利用该平台，研究者分别进行了基于丰度和基于IFNγ效应功能的两个全基因组筛选，分别鉴定出P2RY8–Gα13轴作为T细胞肿瘤浸润的负调控因子，以及GNAS作为T细胞功能障碍的关键驱动因子。GNAS编码的Gαs是多个感知不同抑制性配体的GPCR下游的汇聚节点，GNAS敲除能够使T细胞抵抗多种抑制性信号，在多种CAR和TCR实体瘤模型中显著增强治疗效果。P2RY8与GNAS的联合敲除通过同时增强浸润和抗抑制能力，实现了更优的肿瘤控制。该平台具有灵活性和可扩展性，可适配不同的筛选形式、肿瘤类型和读数方法，为系统发现提高实体瘤T细胞治疗效力的基因策略提供了有力工具。
六、研究亮点
第一，首次实现了在荷瘤小鼠中对原代人T细胞进行全基因组CRISPR筛选，解决了体内筛选覆盖度的技术瓶颈。第二，发现了P2RY8这一人类特异性基因在T细胞肿瘤浸润中的负调控作用，该基因在小鼠中缺乏功能性直系同源物，因此无法通过完全小鼠模型发现。第三，鉴定了GNAS作为多种免疫抑制性GPCR信号的汇聚节点，其敲除能够同时抵抗腺苷、前列腺素E2、酸性和肾上腺素能等多种抑制信号。第四，证明了体内筛选能够发现体外单一应激筛选所遗漏的汇聚性调控因子，突显了体内多重抑制信号共同作用的重要性。第五，展示了将丰度筛选和功能筛选结果进行组合编辑（P2RY8–GNAS双敲除）以协同增强T细胞治疗效果的策略。第六，该平台具有高度的灵活性和可扩展性，可适配CRISPR激活、开放阅读框、碱基编辑、多重扰动以及perturb-seq等多种筛选形式和读数。
七、其他有价值内容
研究还指出，尽管该平台使用多克隆而非抗原特异性激活，但肿瘤浸润T细胞表现出与患者TIL相似的功能障碍特征，且筛选命中的靶标在多种CAR和TCR系统中针对内源性肿瘤抗原得到了稳健验证。此外，未来可考虑将平台扩展至人源化小鼠模型以支持多谱系人类细胞移植，或采用人-鼠CD3ε嵌合策略在免疫健全小鼠中进行混合体内筛选，以进一步提高平台的生理相关性。