该研究由Jian Liang、Weigang Dai、Chuanghui Liu（共同第一作者）以及通讯作者Yongming Chen、Wei Wang、Hailin Tang等人共同完成。主要研究机构包括广州中医药大学药物科学与技术学院（中医证候国家重点实验室）、中山大学肿瘤防治中心（华南肿瘤学国家重点实验室、广东省临床癌症研究中心）以及广州中医药大学东莞研究院。该研究论文于2024年4月19日在线发表于国际知名期刊 Advanced Science 上。
溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）是一种复杂且反复发作的肠道疾病，属于炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD）的主要类型。其临床特征表现为从直肠向近端结肠连续蔓延的弥漫性肠道黏膜炎症，患者常伴有腹痛、腹泻、直肠出血及体重下降等症状，严重影响生活质量，并显著增加结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）的发病风险。目前临床上用于治疗UC的药物（如氨基水杨酸、柳氮磺吡啶及免疫抑制剂等）种类有限，且常导致耐药性和不良反应。因此，开发新型有效的治疗药物迫在眉睫。
既往研究证实，白细胞介素-17（IL-17）信号通路在免疫炎症相关疾病中发挥关键作用。IL-17受体A（IL-17RA）是IL-17受体家族的核心亚基，其被激活后可通过接头蛋白ACT1和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6），激活下游的核因子-κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，进而释放大量促炎细胞因子及趋化因子，加速肠道炎症反应并破坏肠道屏障功能。因此，靶向抑制IL-17RA信号被认为是治疗UC的潜在策略。
姜烯酮A（Gingerenone A, GA）是从生姜（Zingiber officinale）中分离出的一种酚类化合物，已知具有抗炎等多种药理活性。尽管生姜治疗UC的疗效已在临床和动物模型中得到证实，但GA对UC的作用及机制尚不清楚。研究者因此提出假设：GA可能通过调控IL-17RA信号通路来改善UC，并开展了此项研究，旨在首次探究GA对UC的保护效果及其深层分子机制。
本研究是一项综合运用体内动物模型、体外类器官模型、多组学分析及分子生物学技术的原创性研究，主要包含以下几个相互验证的研究程序：
程序一：体内评价GA对DSS诱导的结肠炎小鼠模型及结肠炎相关结直肠癌（CAC）模型的疗效。 研究采用雄性C57BL/6小鼠（6-8周龄）。在急性UC模型中，小鼠自由饮用3%的葡聚糖硫酸钠（DSS）水溶液7天以诱导结肠炎，同时每日灌胃给予低、高剂量的GA（5 mg/kg 和 20 mg/kg）或阳性对照药5-氨基水杨酸（5-ASA, 100 mg/kg），每组12只。通过记录体重、腹泻和便血情况计算疾病活动指数（DAI）评分（样本量n=8-10），实验结束时测量结肠长度（n=8）并取结肠组织进行苏木精-伊红（H&E）染色以分析病理损伤（n=8）。在CAC模型中，小鼠先腹腔注射氧化偶氮甲烷（AOM, 10 mg/kg），一周后饮用2.5% DSS水溶液7天，然后恢复10天，此循环重复3次。同时给予GA（5和20 mg/kg）或5-氟尿嘧啶（5-FU, 20 mg/kg）处理，实验结束后统计结肠肿瘤数量（n=5）并进行组织病理学分析（n=5）。
程序二：探究GA对UC小鼠肠道黏膜炎症和屏障功能的影响。 在DSS诱导的UC小鼠模型中，收集结肠组织和血清样本。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测结肠组织（n=6）和血清（n=6）中促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α）的水平，并测定结肠组织中髓过氧化物酶（MPO）活性（n=6）。通过免疫组织化学（IHC）分析结肠组织中中性粒细胞标志物NIMP-R14的表达（n=6），评估炎症细胞浸润。为评价肠道屏障功能，小鼠口服灌胃异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-dextran, FD-4），检测其在血清中的浓度以分析肠道通透性（n=6）。利用免疫荧光（IF）技术观察结肠组织中紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin）和黏蛋白-2（MUC-2）的表达与分布（n=3）。最后，对各指标间的相关性进行皮尔逊热图分析（n=3）。
程序三：体外验证GA对DSS诱导的肠道类器官损伤的保护作用。 从小鼠小肠中分离隐窝，并在含有Wnt3a、R-Spondin3和Noggin等生长因子的培养基中培养成肠道类器官。首先通过MTT法筛选GA的安全有效浓度范围（1-32 μM）。然后，用0.1%的DSS刺激类器官以模拟体内损伤，并同时加入GA（2、4、8 μM）共培养10小时。观察类器官的形态变化和凋亡情况（n=4），检测培养上清中促炎细胞因子的分泌（n=4），并通过免疫荧光评估类器官中ZO-1、Occludin和MUC-2的表达（n=4）。
程序四：通过转录组学分析和体内外实验揭示GA的作用机制与IL-17RA信号通路的关系。 对对照组、DSS模型组和GA治疗组小鼠的结肠组织进行RNA测序（RNA-seq）。利用京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析富集到的差异基因通路，并绘制热图展示IL-17信号通路及相关下游基因的表达变化（以|Fold Change| ≥ 1.5 和 False Discovery Rate < 0.05为标准）。通过蛋白质印迹法（Western blot）检测结肠组织中IL-17RA、ACT1、TRAF6以及下游NF-κB和MAPK信号通路关键蛋白的磷酸化水平（n=3）。此外，构建重组小鼠IL-17A（rmIL-17a）诱导的肠道类器官和NCM460细胞损伤模型，使用GA干预后，检测炎症因子水平（n=4），并测量跨上皮电阻（TER）和FITC-dextran通透性（n=4）以评估屏障功能，同时通过Western blot检测IL-17RA信号通路的激活情况（n=3）。
程序五：确证GA的直接作用靶点为IL-17RA蛋白。 为探究GA是否直接结合IL-17RA，采用pull-down实验，将GA与琼脂糖珠偶联后与NCM460细胞蛋白裂解液共孵育，检测沉淀物中的IL-17RA（n=3）。进一步利用表面等离子体共振（SPR）技术分析GA与IL-17RA蛋白的结合动力学参数（n=3，浓度范围25-400 nmol/L）。同时，进行细胞热位移分析（CETSA）验证GA在细胞内环境下对IL-17RA蛋白热稳定性的影响（n=3）。最后，通过分子对接和分子动力学模拟，预测并分析GA与IL-17RA蛋白的结合模式、关键结合位点和结合自由能。
程序六：通过功能丧失和药物联用实验证实GA的UC保护作用依赖于IL-17RA信号。 利用慢病毒介导的RNA干扰技术在肠道类器官中分别敲低Il17ra和Act1基因。在敲低后的类器官中使用DSS刺激并加入GA处理，检测炎症因子分泌（n=3）和屏障蛋白基因Tjp1、Occludin、Muc2的mRNA表达水平（n=3），观察GA的保护作用是否被削弱。同时，在DSS诱导的UC小鼠模型上进行GA与IL-17RA单克隆抗体布罗达单抗（brodalumab）或IL-17A拮抗剂伊克珠单抗（ixekizumab）的联用实验（每组n=6），通过观察临床指标、结肠长度和肠道屏障功能，分析两者是否产生竞争性拮抗效应。
体内实验结果（程序一、二）：GA显著缓解了DSS诱导的结肠炎。高剂量GA（20 mg/kg）能有效抑制小鼠体重下降，降低腹泻、便血评分和DAI评分，并以剂量依赖性方式保护结肠免于缩短。病理分析显示，GA处理组的结肠组织结构破坏、杯状细胞消失、炎性细胞浸润等病理损伤较DSS组显著减轻。在AOM/DSS诱导的结直肠癌模型中，GA治疗组的小鼠结肠肿瘤数量明显减少，且大尺寸肿瘤比例降低，显示GA具有抑制结肠炎相关肿瘤发生的作用。在机制研究层面（程序二），GA显著降低了结肠组织和血清中促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α）水平及MPO活性。IHC结果显示，GA能显著减少结肠组织内中性粒细胞（NIMP-R14阳性）的浸润。肠道屏障功能检测发现，GA能够降低UC小鼠血清FD-4水平（即降低肠道通透性），并增强结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和黏蛋白MUC-2的免疫荧光强度。相关性分析确认了GA的治疗效果与抑制炎症、恢复屏障功能之间存在显著正相关。
体外类器官实验结果（程序三、五）：在DSS或rmIL-17a诱导的肠道类器官损伤模型中，GA呈剂量依赖性地保护类器官结构完整性，抑制上皮细胞凋亡和类器官崩解。与体内结果一致，GA处理可显著减少促炎细胞因子的分泌，并恢复紧密连接蛋白和MUC-2的表达。在NCM460细胞上，GA还能显著提升因rmIL-17a刺激而降低的TER值，并减少FD-4的通透率。
机制揭示结果（程序四、五、六）：RNA-seq和KEGG分析将焦点锁定在IL-17信号通路。热图结果显示，GA处理能显著回调DSS诱导的IL-17RA、ACT1、TRAF6及其下游趋化因子基因的表达上调。Western blot结果进一步证实，GA可抑制UC小鼠结肠及rmIL-17a刺激类器官中IL-17RA、ACT1、TRAF6的蛋白表达，并抑制下游NF-κB（p-p65、p-IKKβ、p-IκBα）和MAPK（p-ERK、p-JNK、p-p38）通路的磷酸化激活。靶点识别实验取得了关键突破。Pull-down实验显示GA与IL-17RA蛋白特异性结合，而不结合ACT1。SPR分析则从动力学层面证实GA与IL-17RA之间存在直接、浓度依赖性的相互作用。CETSA实验表明，GA的结合可显著增加IL-17RA蛋白在高温下的热稳定性。分子对接和动力学模拟揭示了其结合细节：GA通过氢键（与ASN-557、ASP-527残基）和疏水作用嵌入IL-17RA蛋白，结合能高达-18.69 ± 1.46 kcal/mol，且复合物构象高度稳定。最终的功能验证实验中，在类器官上敲低Il17ra或Act1基因后，GA抑制炎症因子和恢复屏障相关基因表达的能力大幅减弱。与此相符，在UC小鼠模型中，将GA与brodalumab或ixekizumab联合使用时，并未表现出协同增效作用，反而使GA的治疗效果显著削弱，这表明GA与抗体药物存在对IL-17RA靶点的竞争性结合。
该研究首次证实了姜烯酮A（GA）能通过口服途径有效缓解DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎，表现为抑制肠道黏膜炎症和恢复肠道屏障功能。其核心机制在于GA可作为小分子抑制剂，直接结合IL-17RA蛋白，进而阻断IL-17RA/ACT1/TRAF6信号复合物的形成，抑制下游NF-κB和MAPK炎症信号通路的激活，最终实现对溃疡性结肠炎的保护作用。
本研究的科学价值在于，它不仅为UC的治疗提供了一个极具潜力的新型天然候选药物，更首次清晰地阐明了GA治疗UC的直接作用靶点为IL-17RA。这为基于结构优化设计新一代抗UC药物的研发奠定了坚实基础，将传统中药有效成分与其现代分子药理学靶点直接关联。在应用价值上，鉴于UC临床用药选择的局限性，这一发现为开发源自天然产物、机制明确、副作用可能更小的口服抗UC药物开辟了新方向。