在《Nature Chemical Biology》期刊于2025年在线发表的一项研究中，一个由美国、奥地利、英国、日本等多国研究机构组成的国际团队，包括通讯作者Georg E. Winter和Michael A. Erb及其同事，报道了一种利用高通量化学配体多样化技术前瞻性发现化学诱导接近作用分子（Chemical Inducers of Proximity, CIPs）的新策略。该研究成功地将已知靶向ENL（eleven-nineteen leukemia）或BRD4（bromodomain-containing protein 4）蛋白的配体转化为全新的分子胶型降解剂，揭示了这些分子通过独特的、依赖靶蛋白预结合的协作机制招募E3泛素连接酶，为药物发现，特别是针对“不可成药”靶点提供了有力的新工具。
该研究的学术背景源于化学生物学和药物发现领域对CIPs的迫切需求。CIPs是一类能够稳定生物分子相互作用的小分子，包括异双功能降解剂（如PROTACs）和分子胶。它们通过“诱导接近”重写细胞内的生物化学通路，展现出超越传统抑制剂的治疗潜力。然而，与基于理性设计的异双功能分子相比，分子胶的发现长期以来主要依赖偶然性。研究团队注意到，一些已发现的分子胶与其无效的结构类似物之间仅有微小的表面修饰差异，这些细微变化能形成复合的蛋白质-配体界面，进而稳定界面间的蛋白质-蛋白质相互作用。这启发他们思考：是否可以通过系统性修饰已有配体的化学结构，来主动发现能将蛋白质招募到复合界面的CIPs？为了验证这一设想，他们需要一种能够大规模、高效合成配体衍生物并直接进行表型筛选的方法，以从海量修饰中找出具有新功能（如诱导靶蛋白降解）的分子。
研究团队设计并实施了一个系统的工作流程，核心在于将硫（VI）氟交换（Sulfur(vi) fluoride exchange, SuFEx）高通量化学（High-throughput chemistry, HTC）与基于细胞表型的功能筛选相结合。整个研究分为几个关键步骤。
首先，研究人员选取了两个明确的蛋白质靶点及其已知配体：针对ENL YEATS结构域的小分子SR-0813（研究中简化为TM-7），以及针对BRD4溴结构域的小分子JQ1。他们分别合成了带有SuFEx反应中心（亚氨基硫氧二氟化物）的TM-7二氟化物和JQ1二氟化物前体分子。
其次，是HTC库的构建。研究团队利用SuFEx反应条件温和、能在DMSO-PBS混合体系中快速与伯胺/仲胺发生反应的特性，从商业来源获得了3,163个结构多样的胺类构建块（Building blocks）。然后，在96孔板中并行合成了超过3,000个TM-7和3,000个JQ1的衍生物。反应的粗产物无需纯化即可直接用于细胞实验，这极大地提高了筛选通量，实现了化学合成与生物学筛选的无缝衔接。
第三，是靶向蛋白降解的表型筛选。研究人员使用了工程化的细胞系，通过CRISPR介导的HaloTag标记靶蛋白（如ENL或BRD4），并利用细胞发光信号来实时监测靶蛋白的稳定性。具体而言： - 对于TM-7衍生物库，将反应粗产物加入表达HaloTag-ENL的MV4;11急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）细胞中，筛选能够降低ENL发光信号的化合物。 - 对于JQ1衍生物库，则在表达HaloTag-BRD4的细胞中进行类似的筛选。 筛选后，对初筛“命中”的化合物进行重新合成、纯化，并在更优的细胞模型中进行剂量-效应验证和反筛选，以排除假阳性（如对非靶标蛋白有作用的化合物）。
第四，对命中化合物的作用机制进行深入探究。这是研究的核心部分，包含了多层次的验证实验。 对于从TM-7库中发现的先导化合物rac-DHTC1（后拆分为S型和R型对映体），研究团队进行了一系列实验来阐明其作用机理： 1. 降解特性确认：在多种AML细胞系中，通过免疫印迹和HaloTag定量，证实了DHTC1能有效、快速、持续地降解内源性ENL，并展现出剂量和时间依赖性。 2. 机制验证：通过遗传学筛选，确定ENL降解依赖于泛素-蛋白酶体系统，特别是Cullin-Ring E3泛素连接酶CRL4^CRBN。CRBN基因敲除（Knockout, KO）或使用CRBN配体泊马度胺（Pomalidomide）进行竞争，都能阻断DHTC1的降解活性。 3. 结合特性分析：与传统的CRBN降解剂（如团队此前报道的PROTAC分子SR-1114）不同，DHTC1显示出独特的结合模式。表面等离子共振、荧光偏振竞争结合等体外实验表明，DHTC1单独对CRBN的亲和力极弱（KD ~ 50 µM），远低于其在细胞内的降解效力（DC50为nM至µM级）。只有在预先与ENL YEATS结构域结合形成复合物后，DHTC1才能以高亲和力协同性地招募CRBN，协同因子α高达220倍。而SR-1114无论是否存在ENL，都能有效结合CRBN。这表明DHTC1的功能高度依赖于“ENL-DHTC1”二元复合物的预先形成。 4. 结构生物学研究： - 通过冷冻电子显微镜（Cryo-EM），解析了DDb1-CRBN-(S)-DHTC1-ENL YEATS四元复合物的高分辨率结构（2.6 Å）。 - 结构显示，(S)-DHTC1同时占据ENL的乙酰赖氨酸结合口袋和CRBN的免疫调节药物结合口袋。 - 关键发现：CRBN与ENL YEATS结构域之间存在一个广泛的、高形状互补性的蛋白质-蛋白质相互作用界面，埋藏溶剂可及表面积达2258 Ų。这个界面包含多个关键的分子间相互作用，如CRBN的H353与ENL的E74之间的氢键，以及CRBN的F102/F150与ENL的R16之间的阳离子-π相互作用等。 5. 定点突变验证：基于结构信息，对界面关键残基进行突变（如ENL E74A， R16A， K72A）。这些突变体完全或显著抵抗(S)-DHTC1介导的降解，但对SR-1114仍然敏感，直接证明了这些蛋白-蛋白接触对于DHTC1的协作机制至关重要。
第五，扩展性研究。为了验证HTC策略的普适性，团队对JQ1衍生物库的命中化合物进行了类似探究。他们发现了两个化合物：DHTC2和DHTC3。通过CRISPR生长筛选和基于报告基因的筛选，他们发现DHTC2的活性依赖于CRL4^DCAF16，而DHTC3则首次被发现依赖于一个全新的E3连接酶效应器——SCF^FBXO3复合物。进一步研究表明，DHTC3是BRD4溴结构域1（BD1）特异性的降解剂，并且其活性也需要预先与BRD4 BD1结合，提示其可能也是一种新型的分子胶。
该研究的主要结果相互支撑，逻辑清晰。HTC筛选的结果直接导致了全新降解剂DHTC1和DHTC3的发现。DHTC1独特的弱CRBN单体亲和性与强细胞活性的矛盾，引导研究者提出并验证了其依赖靶蛋白预结合的协作机制假说。结构生物学和定点突变实验为这一机制提供了决定性证据。而DHTC3的发现则展示了HTC策略在发现新型效应器（FBXO3）方面的巨大潜力，这些效应器通过传统的理性设计难以预测和靶向。
本研究得出的结论是：高通量化学配体多样化（HTC）是一种强大且便捷的工具，能够用于前瞻性发现新的化学诱导接近作用分子（CIPs），包括具有独特协作机制的分子胶，以及用于邻近药理学的新型效应器。DHTC1作为一个“分子胶”降解剂，其作用机制与传统CRBN降解剂有本质区别，它通过扩展的蛋白质-蛋白质接触界面，仅在形成“靶标-配体”复合物后才能高效招募CRBN，这提供了更高的选择性，并避免了独立结合CRBN可能带来的脱靶降解风险。DHTC3则成功地将SCF^FBXO3这一此前未被小分子利用的E3连接酶引入了邻近药理学的工具箱。
这项研究的科学价值与应用价值均十分突出。在科学上，它首次系统地证明了通过大规模化学修饰已知配体表面，可以主动创造分子胶，并将这一过程从偶然发现转变为可探索的发现策略。DHTC1-ENL-CRBN三元复合物结构首次揭示了CRBN N端结构域如何通过与靶蛋白形成广泛界面来介导协作性招募，加深了对分子胶作用机制的理解。在应用上，HTC策略为药物研发，尤其是针对缺乏明确可配体口袋的“不可成药”靶点，提供了一条全新的途径。(S)-DHTC1具有良好的理化性质和药代动力学特性，在小鼠AML异种移植模型中能有效降解ENL、抑制下游靶基因表达并诱导分化标志物CD11b的上调，为ENL作为白血病治疗靶点提供了优秀的化学探针。而DHTC3的发现则开辟了利用FBXO3进行靶向蛋白降解的新方向。
本研究的亮点在于： 1. 方法学创新：将SuFEx高通量化学与活细胞表型筛选直接耦合，创造了一个“化学合成-功能筛选”一体化的高效发现平台，实现了从海量化学空间中直接挖掘具有新功能分子的目标。 2. 机制深度解析：对DHTC1的协作性作用机制进行了从细胞、生化到原子水平的全方位、多层次的深入剖析，特别是通过冷冻电镜结构阐明了其独特的蛋白质-蛋白质界面，为分子胶设计提供了宝贵的结构模板。 3. 发现新型效应器：不仅发现了新的分子胶降解剂，更重要的是，通过效应器未知的筛选，成功发现了FBXO3这一全新的、可用于小分子介导的靶向蛋白降解的E3连接酶受体，显著扩展了邻近药理学的工具集。 4. 提供优质探针：(S)-DHTC1及其无效对映体®-DHTC1构成了一个理想的对立体控制组，其良好的体内外活性使其成为研究ENL生物学功能和治疗潜力的优秀工具分子。
此外，研究还发现DHTC1虽利用CRBN，但并未诱导降解任何已知的CRBN新底物（如IKZF1），这暗示其协作性机制可能避免了传统CRBN配体的脱靶降解风险，在安全性设计上具有潜在优势。这项研究标志着在理性设计分子胶的道路上迈出了关键一步，为未来开发更复杂、更特异的靶向治疗药物奠定了坚实的方法学和理论基础。