基于卵巢器官功能重建的生育力保存技术前沿综述
本文为一篇发表于 Frontiers in Physiology 期刊（2023年5月12日在线发表）的学术综述。作者为来自华中科技大学同济医学院附属同济医院妇科肿瘤科以及国家妇产疾病临床医学研究中心、癌症生物学研究中心（教育部重点实验室） 的胡柏、王人杰、吴迪、龙睿、阮婧晗、金蕾、马丁、孙朝阳*和廖书杰*（*为通讯作者）。该论文系统性地回顾并展望了当前以体外卵巢器官功能重建技术为核心的生育力保存策略，旨在为癌症及卵巢早衰（Premature Ovarian Failure, POF）患者的未来生育力保护研究提供新思路。
核心议题：传统生育力保存的挑战与体外重建技术的新希望
如今，随着恶性肿瘤发病年轻化，化疗和放疗对卵巢功能产生即时和长期的负面影响。化疗可能直接杀死生长中的卵泡，诱导POF，并可能通过破坏血管和基质，加速卵泡池的耗竭。放疗对卵泡的破坏与辐射剂量直接相关，5 Gy的全身照射可导致100%的卵泡被破坏。
为满足患者的生殖与内分泌需求，在接受抗癌治疗前冷冻保存卵巢组织并进行移植，是目前主要的生育力保存手段。然而，对于患有血源性白血病或卵巢转移风险高的癌症（如某些卵巢癌）的女性，移植存在肿瘤细胞再引入的风险。因此，开发不依赖移植的体外卵巢功能重建技术，已成为该领域的核心研究焦点。
本综述聚焦于四项前沿的卵巢器官功能重建技术：卵泡体外培养、基于多能干细胞（Pluripotent Stem Cells, PSCs）的卵子发生诱导、人工卵巢构建以及卵巢类器官构建。这些技术旨在最大化所有接受生育力保存患者的潜力。
主要技术体系详述
一、 卵泡体外多阶段培养系统
卵泡是卵巢的基本功能单位。体外多阶段培养系统旨在模拟卵泡在体内的完整发育过程，主要包括三个步骤：体外激活（In Vitro Activation, IVA）、体外生长（In Vitro Growth, IVG）和体外成熟（In Vitro Maturation, IVM）。
卵泡体外激活（IVA）： 这是启动卵泡发育的关键步骤。休眠的原始卵泡由单层扁平的前颗粒细胞包裹初级卵母细胞构成，其静止状态受多条信号通路精密调控。
- 核心信号通路：
- PI3K-PTEN-AKT-FOXO3通路： 被公认为调节卵泡生长分化的主要非促性腺激素生长因子信号通路。抑制PTEN或激活PI3K可促进AKT磷酸化，进而使细胞核内的休眠因子FOXO3a出核，解除对卵母细胞发育的抑制，从而激活原始卵泡。临床研究已使用PI3K激动剂（740Y-P）和PTEN抑制剂（bpV(HOpic)）成功激活部分POF患者的卵泡并获得活产。
- mTORC1-KITL通路： 前颗粒细胞中的mTORC1是接收激活信号的关键因子。其活性增强可刺激KIT配体分泌，与卵母细胞上的KIT受体结合，进一步激活PI3K通路，形成级联放大。
- Hippo信号通路： 在体外培养条件下，通过物理切割卵巢组织可以破坏该通路。组织边缘前颗粒细胞的接触抑制被解除，导致YAP/TAZ进入细胞核，促进前颗粒细胞的发育，进而通过mTORC1-KITL通路激活卵母细胞。此法无需添加化学药物，安全性较高，常与PI3K通路调控协同使用。
- 其他通路与因子： Wnt/β-catenin、Foxl2、p27等基因也参与调控。此外，在培养基中添加人血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒复合物（ITS）、促卵泡激素（FSH）、生长分化因子9（GDF9）、骨形态发生蛋白15（BMP15）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等，均被证明有利于原始卵泡的激活和早期生长。
- 挑战与优化： 激活剂的潜在DNA损伤风险、无药物激活方案的效率问题，以及如何安全、高效地激活卵巢组织（而非分离的卵泡）是当前的研究重点。
卵泡体外生长（IVG）： 卵泡发育至次级阶段（具有多层颗粒细胞）后，需从卵巢皮质中分离出来单独培养，否则其进一步发育会受到抑制。
- 分离方法： 主要包括机械法（使用细针）和酶消化法（使用胶原酶等）。机械法能更好地保持卵泡结构完整性（包括完整的卵泡膜细胞层和基底膜），但效率较低；酶法效率高，但可能损伤细胞。研究表明，优化的细胞分离试剂盒可能提供更好的平衡。
- 培养策略： 维持卵泡的正常三维结构至关重要。传统的液滴培养法成功率有限。组织工程学的应用为此带来革新：
- 生物材料包裹： 使用海藻酸钠等天然水凝胶包裹卵泡，能提供细胞外基质样的支持，维持卵泡结构，允许营养交换，并模拟一定的力学环境。研究显示，从海藻酸钠水凝胶中释放卵泡并进行后续培养的两步法策略，比单纯包裹培养能获得更高的成熟卵母细胞（MII期）率。
- 三维支架： 使用脱细胞卵巢基质或合成的三维微孔支架，能更好地模拟体内的卵泡微环境，支持更长期的生长和发育。
- 添加因子： 在培养基中添加激活素A（Activin-A）和低剂量FSH有助于维持细胞间连接、提高卵母细胞质量并促进卵泡健康生长及卵泡腔形成。bFGF也被证明能促进人卵巢早期卵泡的发育。
卵泡体外成熟（IVM）： 这是指将IVG获得的卵母细胞-卵丘复合体进行培养，支持其恢复减数分裂至MII期。
- 成熟调控： 卵母细胞成熟受环磷酸腺苷（cAMP）水平精密调控。颗粒细胞分泌的C型利钠肽（CNP）通过卵丘细胞上的受体维持卵母细胞内高cAMP水平，使其处于减数分裂停滞状态。黄体生成素（LH）峰值会降低cAMP水平，重启减数分裂。
- 优化策略：
- 使用CNP预处理或联合使用磷酸二酯酶抑制剂（如西洛酰胺）和腺苷酸环化酶激活剂（如毛喉素）来调控cAMP水平，可同步卵母细胞核与胞质的成熟过程，提高成熟率和后续胚胎发育潜力。
- 添加GDF9可显著提高受精和囊胚存活率；生长激素（GH）可提高人卵母细胞的IVM成熟率；褪黑素则通过保护线粒体功能，提高受精后的囊胚形成率。
- 当前局限： 整个多阶段培养系统目前仍受限于MII期卵母细胞获得率低、受精能力不稳定以及安全性验证不足等问题。未来需对各阶段进行大量优化研究，以建立统一、标准、高效且安全的培养体系。
二、 基于多能干细胞的卵子发生、生长与成熟诱导
利用多能干细胞（包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞）在体外诱导产生卵母细胞，为缺乏卵泡储备的患者提供了全新的生育力保存可能。
小鼠模型的成功范例： 研究已实现将小鼠多能干细胞分化为原始生殖细胞样细胞（Primordial Germ Cell Like-Cells, PGCLCs），随后通过与小鼠雌性性腺体细胞聚集形成“重组卵巢”，移植到小鼠卵巢囊膜下，最终发育为MII期卵母细胞，并经体外受精获得健康可育的后代。更进一步的突破是，在无需移植的情况下，完全在体外培养系统中重现了卵子发生的核心事件（减数分裂、卵母细胞生长、基因组印记重建），并获得了可育的后代。关键转录因子（如DAZL、PRDM14等）的过表达也被用于促进生殖细胞分化和减数分裂启动。
人类研究的进展与挑战： 研究者已成功将人诱导多能干细胞分化为人原始生殖细胞样细胞（hPGCLCs），其转录组和表观遗传特征与体内发育相应阶段的PGCs相似。
- 主要障碍： 推动hPGCLCs进一步分化为功能性卵母细胞面临巨大挑战。核心困难在于获取人卵巢体细胞（如颗粒细胞、卵泡膜细胞）进行共培养，以及目前对启动人类减数分裂的关键信号了解不足。
- 当前策略：
- 构建“异种重组卵巢”：将hPGCLCs与小鼠卵巢体细胞共培养并移植。产生的细胞具有卵母细胞特征和部分表观遗传重编程，但未能成功启动完整的减数分裂，提示小鼠体细胞可能无法提供正确的人类减数分裂信号。
- 自体细胞来源：一种前景广阔的方案是，从患者体细胞重编程获得iPSCs，然后分别诱导分化为hPGCLCs和卵巢颗粒样细胞，再将两者结合构建“全人源重组卵巢”或类器官，在体外模拟卵巢微环境，支持卵母细胞发育。
- 技术支持： 单细胞测序技术揭示了人类PGC分化不同阶段的基因表达和表观遗传调控图谱；三维诱导系统和大规模培养方案提高了PGCLC的生产效率。未来，结合三维人工卵巢或类器官技术，可能提供更贴近体内的培养环境。
三、 人工卵巢构建技术
该技术旨在利用组织工程材料构建一种基质环境，用于包裹和支撑卵泡，使其在移植后能够在体内存活、生长、分泌激素并最终排卵。
- 材料选择标准： 理想的支架材料需具备生物安全性、生物相容性、可降解性、适宜的机械强度（以支持卵泡生长和血管生成）、高渗透性（允许营养和信号分子交换），并能促进细胞粘附、增殖和分化。
- 主要材料类型及应用：
- 天然聚合物： 如胶原蛋白、血浆凝块、海藻酸钠、纤维蛋白。优点是生物相容性好，利于细胞信号交流；缺点是机械强度弱、降解快（如血浆凝块、纤维蛋白）。海藻酸钠强度高但不易被人降解，可能限制血管长入。将海藻酸钠与纤维蛋白结合形成互穿网络，能兼得两者的优点。
- 脱细胞卵巢基质： 去除卵巢细胞的天然细胞外基质支架，能高度模拟体内卵巢的微观结构和生物信号，支持细胞生长和卵泡发育。但异种来源存在免疫排斥和病原体残留风险。
- 合成聚合物： 如聚乙二醇，其机械性能可调控，但降解产物可能有毒或引发免疫反应。
- 生物3D打印： 能够精确控制支架的孔径、孔道结构和力学性能。研究已成功使用3D打印的明胶支架移植小鼠卵泡，实现了卵泡发育、激素分泌、血管生成和活产。在支架中设计微血管通道是解决大体积移植体血供问题的关键方向。
- 功能强化： 在支架中加入血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、1-磷酸鞘氨醇（S1P）等生长因子，可有效促进移植后的血管生成，减少卵泡凋亡，提高移植物存活率和功能恢复。
四、 卵巢类器官构建技术
类器官是在三维培养条件下，由干细胞或器官祖细胞自我组织形成的、在结构和功能上模拟真实器官的迷你组织模型。
- 研究进展： 2021年，研究者首次利用雌性生殖干细胞（FGSCs）通过三维培养系统诱导出生成了卵巢类器官。该类器官包含生殖细胞、颗粒细胞、卵泡膜细胞等至少六种卵巢细胞类型，能够产生卵母细胞并具备内分泌功能，利用此模型甚至获得了正常小鼠后代。该类器官模型可用于研究卵子发育机制和筛选促卵泡发育药物。
- 最新突破： 2023年，有研究团队实现了从人iPSCs直接定向分化为功能性的全人源卵巢类器官。通过过表达转录因子NR5A1和RUNX1/RUNX2，将iPSCs诱导为颗粒样细胞，再与从iPSCs诱导来的hPGCLCs共培养，形成了能够支持卵母细胞发育、卵泡形成和性激素分泌的卵巢类器官。
- 技术组合前景： 提出了一种结合人工卵巢和类器官技术的两步法生物工程卵巢策略：第一步，通过脱细胞技术获得三维生物支架；第二步，利用分选的FGSCs或iPSCs来源的细胞，通过类器官技术进行扩增和分化，再用于重新填充脱细胞支架。这为体外重建具有完整功能的生物工程卵巢提供了强大工具。
- 优化方向： 当前类器官产生卵母细胞的效率仍然较低。优化培养条件（如使用新型Wnt信号激活剂替代传统条件培养基）、添加抗氧化剂（如MitoQ）保护线粒体功能、抑制表观遗传调控因子（如EED）以减少生殖细胞凋亡，是提高类器官质量和卵子发生效率的研究热点。
综述的意义与价值
本综述系统梳理了卵巢器官功能重建领域四大技术方向的最新进展、关键机制、现有挑战和未来展望。其科学价值在于： 1. 知识整合： 为研究人员提供了该领域全面、前沿的知识图谱，清晰指出了从基础生物学机制（如信号通路）到高级技术应用（如组织工程、类器官）的发展脉络。 2. 指明方向： 明确提出了传统生育力保存技术的局限性，并论证了体外重建技术作为重要替代或补充策略的必要性和可行性。特别是针对癌症转移风险患者和POF患者，这些技术提供了新的希望。 3. 交叉融合： 突出了生殖医学、干细胞生物学、组织工程学、材料科学和生物制造等多学科交叉融合在该领域发展的关键作用。 4. 临床转化前瞻： 尽管多数技术尚处于临床前研究阶段，尤其是人类卵子的完全体外生成仍面临重大挑战，但综述中展示的小鼠模型成功案例、人类细胞研究的逐步突破以及不断优化的技术方案，为未来的临床转化奠定了坚实的基础，并描绘了潜在的应用蓝图。该领域的发展不仅关乎生育力保存，也将深化我们对卵巢生理、卵子发生及相关疾病的认识。