针对癌症相关成纤维细胞分泌的Wnt2以恢复树突状细胞介导的抗肿瘤免疫的靶向研究
一、 研究团队与发表信息
本研究的主要作者为黄涂雄 (Tu-xiong Huang)、谭湘玉 (Xiang-yu Tan)、黄慧思 (Hui-si Huang) 等，通讯作者为傅力 (Li Fu) 教授。研究团队主要来自中国深圳大学健康科学中心区域免疫与疾病广东省重点实验室、药理学与国际癌症中心（第一单位），以及深圳市人民医院、香港大学临床肿瘤学系、浙江中医药大学附属第一医院等多个机构。这项原创性研究成果以题为《Targeting cancer-associated fibroblast-secreted Wnt2 restores dendritic cell-mediated antitumour immunity》的论文形式，发表于国际知名胃肠病学期刊《Gut》上。论文于2021年3月10日在线首发，并于2022年正式刊载于第71卷，页码为333-344。
二、 学术背景与研究目的
本研究的科学领域聚焦于肿瘤免疫学，特别是肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）如何介导免疫逃逸，以及如何通过干预TME来增强现有免疫疗法的疗效。尽管以程序性细胞死亡蛋白1（Programmed Cell Death Protein 1, PD-1）/程序性死亡配体1（Programmed Death-Ligand 1, PD-L1）抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitor, ICI）疗法在多种癌症中取得了成功，但许多实体瘤患者对其反应不佳。一个主要的治疗障碍是免疫抑制性的TME。癌症相关成纤维细胞（Cancer-Associated Fibroblasts, CAFs）是TME中含量最丰富的基质细胞，已知在多种实体瘤中负向调控抗肿瘤免疫。然而，CAFs调节抗肿瘤免疫反应的具体机制尚不完全清楚。
研究团队的先前工作发现，成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）是食管鳞状细胞癌（Oesophageal Squamous Cell Carcinoma, OSCC）中促肿瘤CAFs的特异性标志物，并且这些FGFR2+ CAFs能够分泌Wnt2，通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进OSCC的恶性进展。Wnt2在结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）等其他胃肠道（GI）癌症中也由CAFs高表达，并促进疾病进展。同时，Wnt信号通路在免疫细胞（如树突状细胞（Dendritic Cells, DCs）和T细胞）的发育和功能中也扮演重要角色。然而，CAFs来源的Wnt2在调节抗肿瘤免疫中的作用在很大程度上仍是未知的。
基于此背景，本研究旨在：1）揭示CAFs通过分泌Wnt2介导肿瘤免疫逃逸的机制；2）评估靶向CAFs分泌的Wnt2作为增强PD-1抑制剂疗效的新型治疗策略的潜力，研究对象主要为OSCC和CRC。
三、 详细研究流程
本研究采用了从临床样本分析到基础机制探索，再到临床前动物模型验证的完整工作流程，逻辑严谨，层层递进。
流程一：临床相关性分析。 研究首先在47例原发性OSCC患者的石蜡包埋肿瘤组织切片中，通过多重免疫荧光染色技术，检测了促肿瘤CAFs（Wnt2+FGFR2+）、调节性T细胞（Tregs， Foxp3+CD4+）和活性CD8+ T细胞（IFN-γ+CD8+）的表达。使用TissueFAXS系统进行定量分析。目的是在人体肿瘤组织中初步验证Wnt2+ CAFs与免疫抑制性TME的相关性。
流程二：临床前动物模型疗效评估。 为了评估靶向Wnt2的治疗潜力，研究使用了课题组自主研发的高特异性抗Wnt2单克隆抗体（anti-Wnt2 mAb）。该抗体不识别同源性超过40%的其他Wnt蛋白（如Wnt2B, Wnt3A, Wnt5A等），但能同时识别人和小鼠的Wnt2蛋白。在免疫健全的C57BL/6小鼠上，构建了两种同系移植瘤模型：小鼠OSCC细胞系MEC25模型和小鼠CRC细胞系CMT93模型。当肿瘤生长至约5毫米直径时，将荷瘤小鼠随机分组，进行腹腔注射给药，每3天一次，持续2周。分组包括：对照IgG组、单独抗Wnt2抗体组、单独抗PD-1抗体组、以及抗Wnt2与抗PD-1联合治疗组。监测肿瘤生长曲线，并在终点时收集肿瘤组织和脾脏，通过流式细胞术分析肿瘤内和全身的免疫细胞组成和功能状态，包括CD8+ T细胞的活性（IFN-γ产生）、DCs的比例（CD11c+, CD103+）及其活化（TNFα, IL-12表达）和成熟状态（CD80, CD86表达）。
流程三：体外机制探索——CAFs/Wnt2对DC功能的影响。 此部分旨在直接验证CAFs分泌的Wnt2对DC分化及功能的抑制作用。首先，使用重组小鼠Wnt2蛋白（mWnt2）处理从小鼠骨髓中通过GM-CSF和IL-4诱导分化的DCs，评估其对DC分化（CD11c+, CD103+）、活化、成熟以及抗原提呈能力（刺激CD8+ T细胞产生IFN-γ）的影响，并使用抗Wnt2抗体或其Fab片段进行阻断实验。其次，从原发性小鼠OSCC肿瘤中分离出FGFR2+ CAFs（MCAFs），收集其条件培养基（MCAF.CM），用此培养基处理DC前体细胞，观察其抑制DC分化和功能的效果，并同样使用抗Wnt2抗体进行中和。第三，通过慢病毒转染shRNA，构建Wnt2敲低的MCAFs细胞（MCAF-shWnt2）及其对照（MCAF-shNTC），比较它们条件培养基对DC分化和功能的影响。这些体外实验系统地证明了CAFs通过分泌Wnt2来抑制DC功能。
流程四：体内机制验证——CAFs Wnt2敲低对肿瘤生长和免疫的影响。 为了在更复杂的体内环境中验证上述机制，研究设计了一个共移植模型：将MEC25肿瘤细胞与MCAF-shWnt2或MCAF-shNTC细胞按3:1的比例混合后，皮下接种到C57BL/6小鼠体内。通过比较两组小鼠的肿瘤生长、肿瘤浸润淋巴细胞中DCs的比例和状态、以及脾脏CD8+ T细胞的活性，来评估敲低CAFs中的Wnt2是否能在体内逆转其免疫抑制和促瘤作用。
流程五：分子机制深度解析。 为了阐明Wnt2抑制DC分化的下游信号通路，研究进行了RNA测序（RNA-seq）分析。对比了对照组培养基、mWnt2蛋白、MCAF.CM以及MCAF.CM+抗Wnt2抗体处理的DCs的基因表达谱。通过生物信息学分析，筛选出受Wnt2调控的关键基因。随后，通过定量PCR和蛋白质印迹法（Western Blot）验证了关键基因的表达变化。进一步，通过小干扰RNA（siRNA）敲低DC前体细胞中的候选基因，观察其是否能逆转Wnt2对DC分化和功能的抑制。最后，使用特定的信号通路抑制剂进行验证，并检测动物模型中相关信号分子的磷酸化状态。
数据工作流程： 所有流式细胞术数据使用CytoFLEX系统采集，Kaluza软件分析。组织切片图像使用TissueFAXS系统量化。RNA-seq数据上传至NIH GEO公共数据库（编号GSE154420）。统计学分析采用Student’s t检验或双因素方差分析（ANOVA）。
四、 主要研究结果
结果一：在OSCC患者肿瘤中，Wnt2+ CAFs与效应T细胞呈负相关。 对47例OSCC样本的分析显示，Wnt2+FGFR2+ CAFs的密度与肿瘤内Foxp3+ Tregs占CD4+ T细胞的比例呈显著正相关，而与IFN-γ+ CD8+ T细胞占CD8+ T细胞的比例呈显著负相关。根据CAFs密度将患者分为“高Wnt2+”和“低Wnt2+”两组，发现高Wnt2+组具有更高的Tregs比例和更低的活性CD8+ T细胞比例。这首次在临床水平提示Wnt2+ CAFs可能与免疫抑制性TME有关。
结果二：抗Wnt2单克隆抗体治疗有效增强OSCC和CRC模型中的抗肿瘤免疫，并与抗PD-1协同增效。 在MEC25（OSCC）和CMT93（CRC）小鼠模型中，单独使用抗Wnt2抗体能显著抑制肿瘤生长。更重要的是，抗Wnt2与抗PD-1联合治疗产生了比任一单药更显著的肿瘤抑制效果。流式分析表明，抗Wnt2治疗显著增加了肿瘤内活性CD8+ T细胞（IFN-γ+）的比例，同时提升了脾脏CD8+ T细胞的杀瘤活性。机制上，抗Wnt2治疗增加了肿瘤内DCs（包括CD11c+和CD103+亚群）的浸润，并促进了这些DCs的成熟（CD80+, CD86+）和活化（产生TNFα, IL-12）。这表明抗Wnt2疗法通过增加肿瘤内具有免疫刺激功能的DCs，来恢复和增强DC介导的抗肿瘤T细胞反应。
结果三：CAFs分泌的Wnt2在体外直接抑制DC的分化和免疫功能。 重组mWnt2蛋白或MCAFs的条件培养基能有效抑制骨髓来源的CD11c+和CD103+ DCs的分化，并降低LPS刺激后DCs的活化（TNFα+, IL-12+）和成熟（CD80+, CD86+）标志物表达。最关键的是，经肿瘤抗原负载后，这些受Wnt2抑制的DCs激活CD8+ T细胞产生IFN-γ的能力显著下降。使用抗Wnt2抗体中和MCAF.CM中的Wnt2，或使用shRNA敲低MCAFs中的Wnt2表达，都能完全或部分逆转上述所有免疫抑制效应。这直接证明了CAFs是通过分泌Wnt2来抑制DC功能的。
结果四：敲低CAFs中的Wnt2在体内抑制肿瘤生长并恢复DC介导的免疫。 在MEC25与CAFs共移植模型中，与对照组（MCAF-shNTC）相比，接种了Wnt2敲低CAFs（MCAF-shWnt2）的小鼠肿瘤生长更慢，肿瘤重量更轻。肿瘤免疫微环境分析显示，MCAF-shWnt2组小鼠肿瘤中浸润了更多比例的CD11c+和CD103+ DCs，这些DCs的活化（TNFα+, IL-12+）和成熟（CD80+, CD86+）状态也更好，同时肿瘤和脾脏中产生IFN-γ的CD8+ T细胞比例更高。这为“CAFs通过分泌Wnt2在体内抑制抗肿瘤免疫”提供了直接的体内证据。
结果五：Wnt2通过上调SOCS3抑制JAK2/STAT3信号通路，从而阻碍DC分化。 RNA-seq分析发现，细胞因子信号抑制因子3（Suppressor of Cytokine Signaling 3, SOCS3）是受Wnt2和CAFs条件培养基共同显著上调的关键基因。Western Blot验证显示，Wnt2处理能上调DCs中SOCS3蛋白表达，同时抑制JAK2和STAT3（Tyr705位点）的磷酸化激活。抗Wnt2抗体处理可阻断这些变化。功能挽救实验证明，使用siRNA敲低DC前体中的SOCS3，可以逆转Wnt2对DC分化和JAK2/STAT3磷酸化的抑制。此外，使用STAT3磷酸化抑制剂Napabucasin能模拟Wnt2对DC的抑制作用。在动物模型中，Wnt2敲低的CAFs组肿瘤内CD45+白细胞中SOCS3水平降低，而p-STAT3水平升高。这些结果清晰地揭示了Wnt2→SOCS3↑→p-JAK2/p-STAT3↓的信号轴是CAFs抑制DC分化的核心分子机制。
五、 研究结论与价值
本研究得出核心结论：CAFs可通过分泌Wnt2，经由SOCS3/JAK2/STAT3信号级联反应，抑制DCs的分化和功能，从而削弱DC介导的抗肿瘤T细胞反应，促进免疫逃逸。靶向CAFs分泌的Wnt2能够恢复DCs的功能和肿瘤内抗肿瘤免疫，并能显著增强抗PD-1疗法的疗效。
其科学价值在于： 1. 揭示了CAFs介导免疫抑制的新机制： 首次阐明了CAFs来源的Wnt2在调节DCs功能和抗肿瘤免疫中的关键作用，并解析了其下游的SOCS3/JAK2/STAT3信号通路，为理解TME免疫抑制提供了新的理论视角。 2. 提出了肿瘤免疫治疗的新靶点和新策略： 将靶点从肿瘤细胞或免疫细胞自身，拓展到了TME中的关键基质细胞——CAFs及其分泌因子Wnt2。研究证明，针对Wnt2的抗体疗法是一种有前景的、能与现有PD-1抑制剂产生协同作用的联合免疫治疗策略。 3. 具有明确的转化医学潜力： 研究证实抗Wnt2抗体在动物模型中安全有效（Wnt2在正常成人组织中表达有限），为开发针对Wnt2高表达的胃肠道癌症（如OSCC、CRC）的新型免疫疗法提供了坚实的临床前依据。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的观点
研究在讨论部分还提出了未来值得探索的方向： 1. 寻找更特异的CAFs靶标： 虽然FGFR2可标记分泌Wnt2的CAFs，但它在正常组织也有表达，因此寻找更特异的表面标志物对于开发基于CAFs清除的精准治疗策略至关重要。 2. 拓展靶点范围： 本研究提示，靶向其他CAFs诱导的免疫抑制因子，也可能成为增强免疫检查点治疗疗效的可行途径。 3. 对JAK/STAT信号双重角色的思考： 研究注意到了不同文献中JAK/STAT信号在免疫调节中看似矛盾的作用，并指出这种不一致性可能源于不同TME的上下文差异，提示了肿瘤免疫调控网络的复杂性。
这项研究是一项在肿瘤免疫微环境领域具有重要影响力的工作，它不仅深化了对CAFs免疫调节功能的理解，更重要的是为改善实体瘤对免疫检查点抑制剂的反应性提供了一条充满希望的新途径。