异基因iPSC来源iNKT细胞治疗复发性头颈癌：一项1期临床试验

主要作者与机构

该研究由千叶大学（Chiba University）医学研究院耳鼻咽喉头颈外科学系的Tomohisa Iinuma、Tomoya Kurokawa、Toyoyuki Hanazawa，千叶大学医学免疫学系的Shinichiro Motohashi，以及理化学研究所（RIKEN）整合医学科学中心发育遗传学实验室的Haruhiko Koseki等人共同完成。研究发表于《Nature Communications》（2025年，第16卷，文章编号11666），DOI为10.1038/s41467-025-66801-w。

研究背景

恒定自然杀伤T细胞（invariant natural killer T cells, iNKT cells）是一类特殊的T细胞亚群，其T细胞受体（T cell receptor, TCR）由人类Vα24-Jα18和Vβ11链组成，能够识别由单态性MHC I类样抗原呈递分子CD1d呈递的糖脂类抗原（如α-半乳糖苷神经酰胺，αGalCer）。iNKT细胞不仅具有类似NK细胞的直接细胞毒性，还能通过释放干扰素-γ（IFN-γ）激活NK细胞、诱导肿瘤反应性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes, CTLs）以及“授权”树突状细胞（dendritic cells, DCs），从而在启动抗肿瘤免疫中发挥关键作用。然而，既往临床试验表明，患者内源性iNKT细胞对αGalCer/DCs的反应有限，而自体iNKT细胞的体外扩增又存在技术瓶颈。为克服这些问题，研究团队将iNKT细胞重编程为诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs），再将其再分化为iPSC来源的iNKT细胞（iPSC-iNKT cells）。由于CD1d的单态性，异基因iNKT细胞可对异基因DCs产生应答，这为“现成型”细胞治疗提供了可能。复发性头颈鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）的标准治疗选择有限，免疫检查点抑制剂的客观缓解率也较低（nivolumab为13.3%，pembrolizumab为14.6%），因此该研究旨在评估异基因iPSC-iNKT细胞经肿瘤供血动脉输注治疗复发性HNSCC的安全性与初步疗效。

研究流程

本研究为单臂、非盲法、首次人体1期临床试验（注册号：jrct2033200116），采用3+3剂量递增设计。主要终点为剂量限制性毒性（dose-limiting toxicity, DLT）的发生率，次要终点包括安全性、疗效评估以及免疫学动态变化。

临床级iPSC-iNKT细胞的制备：首先从健康成人供者外周血单个核细胞（PBMCs）中分离iNKT细胞，通过GMP级仙台病毒载体导入OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC和SV40大抗原进行重编程，筛选表达多能性标志物且具有Vα24-Jα18基因重排的iNKT细胞来源iPSCs（iNKT-iPSCs），建立主细胞库（master cell bank, MCB）并经日本药品与医疗器械管理局（PMDA）验证。随后，MCB来源的iNKT-iPSCs在GMP级饲养层细胞上分化约30天，获得未成熟iPSC-iNKT细胞并冻存。给药前，将冻存的未成熟iPSC-iNKT细胞复苏，在无饲养层条件下培养约7天，制成终产品。每批终产品均经过质量检测，包括Vα24和Vβ11表达、对K562细胞系的细胞毒性活性以及IFN-γ生产能力。表型分析显示，iPSC-iNKT细胞主要为CD4⁻CD8⁻，表达CD161，组成性表达转录因子PLZF、T-bet和Eomes而不表达RORγt，属于NKT1亚群，TCR刺激后仅产生IFN-γ而不产生IL-4或IL-17。在人头颈癌细胞系FaDu荷瘤的NSG小鼠（敲入人IL7和IL15基因）中，瘤内注射iPSC-iNKT细胞可显著抑制肿瘤生长。

临床试验设计：2020年9月至2023年9月期间，共筛选16例患者，12例入组，最终10例接受iPSC-iNKT细胞输注。首剂量组（3×10⁷ cells/m²）纳入3例，第二剂量组（1×10⁸ cells/m²）纳入7例。细胞通过股动脉插管在透视引导下超选择至肿瘤供血动脉，经造影确认后输注，每2周一次，最多3次。DLT评估期为首次给药至第2周期第14天。

安全性与免疫监测：在每次输注后多个时间点（输注前、0.5、1、2、6、24、48和168小时）采集外周血，检测血清细胞因子（GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α）、PBMCs中T细胞亚群和NK细胞数量、抗HLA抗体以及iPSC-iNKT细胞的药代动力学。在第1天（给药前）、第3天、第8天（部分受试者还包括第21天和末次给药后2周）进行流式细胞术分析。此外，对3例第二剂量组受试者（受试者08、09、12）在第1天、第8天和第21天分离CD3⁺ T细胞和CD56⁺CD3⁻ NK细胞，进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）和TCR测序（scVDJ-seq），共分析146,799个细胞。

数据分析流程：scRNA-seq数据使用Cell Ranger（v7.2.0）处理，以GRCh38为参考基因组；scVDJ-seq数据使用Cell Ranger VDJ流程。整合后的数据使用Seurat v4进行分析，经线粒体基因比例<5%和检测基因数>500的质控过滤后，进行主成分分析（PCA）、聚类和UMAP可视化。差异表达基因（DEGs）通过Metascape进行基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析。TCR克隆型定义为具有至少一条产生性TCRα链和一条产生性TCRβ链的独特α-β配对，克隆扩增定义为第21天与第1天相比细胞数≥8且扩增倍数≥2。

主要结果

安全性：10例受试者中未观察到死亡或细胞因子释放综合征。最常见的不良事件为发热（5例，1–2级），其余包括贫血（1例3级）、荨麻疹（1例1–2级）、斑丘疹（1例3级）等。1例受试者（受试者11）在首次输注后出现3级全身性斑丘疹，被判定为DLT，经全身糖皮质激素治疗后4周内缓解。在第二剂量组6例可评估受试者中确认1例DLT，因此第二剂量（1×10⁸ cells/m²）被确定为最大耐受剂量（MTD）。血清细胞因子检测中仅IL-6和IL-8可检出，但输注后未见显著升高。流式细胞术分析未发现T细胞亚群、NK细胞或iNKT细胞计数的明显变化。抗HLA抗体检测未观察到任何新诱导的抗HLA抗体或供者特异性抗体。药代动力学分析显示，iPSC-iNKT细胞特异性HLA基因在输注后7天内降至检测限以下（除受试者08首次给药外），表明异基因细胞的存留期不超过一周。

疗效：8例可评估受试者中，首剂量组1例疾病稳定（stable disease, SD）、2例疾病进展（progressive disease, PD）；第二剂量组4例SD、1例PD。值得注意的是，第二剂量组的两例SD受试者（受试者08和09）肿瘤长径分别缩小11%和12%。受试者08的CT影像显示，入组前1.5个月内肿瘤长径从39 mm增至46 mm，经2个周期iPSC-iNKT细胞输注后缩小至41 mm。

免疫学动态：在第二剂量组受试者中，CD4⁺和CD8⁺ T细胞的PD-1表达在给药后第8天显著升高（p=0.0313），提示T细胞被激活；NK细胞的PD-1表达在2例受试者中升高，但组间无统计学差异。scRNA-seq分析显示，第8天CD4⁺和CD8⁺ T细胞中上调的DEGs经GO分析富集于IFN-γ信号通路。代表性基因STAT1、IRF1、ISG15和MX1在CD8⁺和CD4⁺ T细胞中于第8天和第21天均表达增加，而IL-4通路相关基因（STAT6、AKT1）未上调。PDCD1（编码PD-1）在CD8⁺和CD4⁺ T细胞中于第8天升高，但在NK细胞中未升高。

TCR克隆扩增分析：比较第1天与第21天的TCR库，CD8⁺ T细胞的克隆扩增较CD4⁺ T细胞更为常见且更为强劲。受试者08、09和12分别鉴定出9、8和1个高效扩增的CD8⁺ T细胞克隆。CD8⁺ T细胞被分为5个亚群：CD8TCF7（初始表型）、CD8CXCR3（记忆表型）、CD8KLRG1（效应表型）、CD8MKI67（增殖型）和CD8RORC（Tc17表型）。在受试者08和09中，克隆扩增主要发生在效应表型（CD8KLRG1）和记忆表型（CD8CXCR3）亚群，且伴随UMAP上的分散分布，提示功能性多样化；而受试者12的扩增较为有限。基因表达比较显示，受试者08的扩增CD8⁺ T细胞中JUN、FOS和CD69等激活相关基因上调，GO分析富集于NF-κB和TCR信号通路；受试者09中FOS和CD69也有轻度上调。

研究结论与意义

本研究首次证明，异基因iPSC-iNKT细胞经肿瘤供血动脉重复输注治疗复发性HNSCC具有良好的安全性，未引起细胞因子释放综合征或针对异基因细胞的抗体产生。尽管iPSC-iNKT细胞在体内的存留时间有限（约一周），但在部分受试者中仍能激活宿主T细胞的IFN-γ通路，诱导效应和记忆表型CD8⁺ T细胞的克隆扩增，并伴随肿瘤缩小。这一发现表明，iPSC-iNKT细胞无需αGalCer/DCs的额外刺激即可发挥免疫佐剂活性，为“现成型”异基因iPSC来源免疫细胞治疗实体瘤提供了首个临床安全性证据。此外，GMP级iNKT-iPSC主细胞库的建立和工业级生产能力的验证，为iPSC-iNKT细胞治疗的规模化应用奠定了基础。

研究亮点

该研究的创新性体现在三个方面：第一，这是异基因iPSC来源iNKT细胞治疗实体瘤的首次人体临床试验，为iPSC来源免疫细胞（尤其是T细胞类）的临床安全性提供了先驱性数据；第二，研究揭示了iPSC-iNKT细胞在无外源刺激条件下通过IFN-γ通路激活宿主CD8⁺ T细胞并驱动克隆扩增的独特免疫机制；第三，研究建立了从iPSC重编程、分化、冻存到临床级终产品制备的完整工艺流程，并通过PMDA验证，展示了工业规模生产的可行性。研究亦指出局限性，包括样本量小、随访时间有限，以及异基因细胞的快速清除可能限制疗效持久性；未来方向包括HLA基因敲除以延长存留、与αGalCer/DCs联合使用以及CAR修饰等策略。